Mutageneze je indukce jedné nebo více mutací v genomu , přesně a dobrovolně. Tato metoda se používá k úpravě struktur DNA , RNA a proteinů . Tuto metodu molekulární biologie vyvinul Michael Smith v roce 1978. Myšlenka na místně řízenou mutagenezi ho zjevně napadla během rozhovoru s Clydem Hutchisonem v roce 1976 na Cambridge Institute v Anglii, když „pracoval na přípravě oligonukleotidy k čištění DNA fragmentů. Tento významný objev mu v roce 1993 vynesl Nobelovu cenu za chemii s Karry Mullisem , vynálezcem polymerázové řetězové reakce .
Metody místně cílené mutageneze jsou založeny na polymerázové řetězové reakci (PCR). Mutace jsou zavedeny pomocí oligonukleotidových primerů, které jsou syntetizovány předem. Tyto primery jsou komplementární k sekvenci divokého typu s výjimkou nukleotidů, které musí být mutovány. Ve skutečnosti PCR nevyžaduje přísnou komplementaritu mezi nukleotidovým primerem a cílovou sekvencí DNA. Na konci PCR reakce jsou mutace zavedeny do produktů a mohou mít tři typy:
1) Substituce: jeden nebo více nukleotidů je nahrazeno stejným počtem různých nukleotidů.
2) Inzerce: do cílové sekvence se přidá jeden nebo více nukleotidů.
3) Delece: ze sekvence je odstraněn jeden nebo více nukleotidů.
Jeden z prvních přístupů k místně cílené mutagenezi je založen na rozšíření překrytí. Ke generování fragmentů DNA s překrývajícími se konci pomocí PCR se používají komplementární primery. Tyto fragmenty jsou kombinovány a jejich hybridizace umožňuje prodloužení oblasti překrytí. Mutace jsou zavedeny specifickým způsobem změnami nukleotidů v sekvenci primerů.
V praxi se k provedení tří PCR reakcí používají dva páry primerů. Primery 1 a 2 nesou mutaci ve své 5 'oblasti a jsou navzájem komplementární. Primery 3 a 4 ohraničují cílovou DNA, která má být amplifikována. První PCR se provádí s primery 2 a 3 a umožňuje amplifikaci levé části cílové DNA včetně mutované oblasti. Druhá PCR, prováděná s primery 1 a 4, produkuje pravou část cílové DNA včetně mutované oblasti. Vyčištěné, smíchané a denaturované produkty těchto dvou PCR mohou hybridizovat mutovanou oblastí, která je pro ně společná. Třetí PCR s oligonukleotidy 3 a 4 poté umožňuje získat úplnou cílovou DNA s mutací.
Mezi další důležité přístupy patří místně zaměřená mutageneze na vektoru QuickChange.
Prostřednictvím PCR je možné mnoho technik :