Heterologní nebo rekombinantní protein je protein produkovaný buňkou, jehož genetický materiál byl změněn genetickou rekombinací .
Gen kódující požadovaný protein je zaveden do genomu produkčního druhu (bakterie, buňky savců v kultuře, transgenní zvířata atd.). Rekombinantní proteiny mohou být čištěny a použity pro terapeutické, průmyslové nebo dokonce výzkumné činnosti.
Bylo to v roce 1972, kdy začala první manipulace genů in vitro. V té době získal biochemik Paul Berg první rekombinantní DNA díky restrikčním enzymům . O rok později se S. Cohenovi a H. Boyerovi podařilo zavést geny obojživelníků do bakterie Escherichia coli . Narodil se první transgenní organismus .
V 80. letech byl uveden na trh první produkt získaný z genetického inženýrství. Jedná se o rekombinantní lidský inzulín produkovaný geneticky modifikovanými bakteriemi. V tomto období si také vědci uvědomili, že ne všechny proteiny produkované touto metodou jsou funkční. Tento problém pramení ze skutečnosti, že bakterie nemají veškerý aparát, který umožňuje proteinům dosáhnout posttranslačního zrání, a tedy získat biologickou aktivitu. Vědci se poté obrátili k modelům eukaryotických buněk . V roce 1982 se narodila první transgenní myš. Produkuje více hormonů než obvykle.
Vektor je prostředek pro transport DNA . Jedná se o fragment schopný autonomní replikace a který může podporovat inzerci jiného fragmentu DNA různé velikosti (bakteriální plazmid).
Organismus dárce exprimuje požadovaný protein. Z tohoto organismu je izolována mRNA kódující tento protein. MRNA umožňuje syntézu cDNA, která bude použita pro klonování. Ve skutečnosti nelze eukaryotickou genomovou DNA použít v bakteriálním systému, protože bakterie nemají mechanismus pro sestřih eukaryotických mRNA.
Proto se k získání cDNA kódující požadovaný gen často používá technika RT-PCR . Po reverzní transkripci celkových mRNA do ssDNA (jednořetězcové) pomocí poly dT primerů specifických pro poly A konce mRNA je cDNA odpovídající mRNA kódující požadovaný protein amplifikována pomocí PCR za použití specifických primerů, ke kterým jsou přidána restrikční místa. který bude poté použit pro klonování.
Regulační sekvenceJakmile je požadovaná cDNA amplifikována, je nutné přidat sekvence umožňující zacílit transkripční tkáň i signály pro ukončení transkripce a translace. Tyto sekvence jsou často přítomny na plazmidu, do kterého je klonován požadovaný gen:
U bakterií není potřeba intronů .
CDNA amplifikovaná pomocí PCR byla klonována do vektoru ( bakteriální umělý chromozom , kvasinkový umělý chromozom , bakteriální plazmid atd.) Obsahující výše popsané regulační sekvence.
Za tímto účelem se vektor (zde plasmid) i cDNA požadovaného genu štěpí různými restrikčními enzymy, aby se orientace inzerce cDNA před ligací cDNA v plazmidu mohla provést pomocí ligázy .
Rekombinantní plazmid je poté transformací zaveden do bakterie, aby se amplifikoval vektor, který se poté purifikuje. Před provedením transgeneze je vektor linearizován a bakteriální replikační signály, stejně jako geny rezistence přítomné na plazmidu, jsou eliminovány pomocí restrikčních enzymů.
Jedná se o techniku spočívající v integraci exogenního genu do genomu hostitelského organismu. Cílem této manipulace je umožnit hostiteli produkovat požadovaný protein, který neprodukuje daný druh, nebo ho produkovat ve větším množství (používá se při výzkumných činnostech).
Bude to provedeno podle požadovaného použití rekombinantního proteinu a buněčných mechanismů nezbytných pro produkci funkčního proteinu:
U bakterií a kvasinek bude transgen buď zaveden do buňky na plazmidu, nebo integrován do bakteriálního genomu dvojitou homologní rekombinací.
U rostlin probíhá integrace rekombinantní DNA pomocí „DNA pistole“, která promítá mikrokuličky ze zlata nebo wolframu potažené DNA nebo pomocí bakterií schopných přenášet bakterie. DNA do hostitelské buňky (např. , Agrobacterium tumefaciens ).
U zvířat se injekce roztoku obsahujícího rekombinantní DNA v lineární formě provádí do samčího pronukleu vaječné buňky před krokem karyogamie . Injikovaná DNA bude integrována do genomu pomocí opravných mechanismů DNA hostitelské buňky. Drosophila, zebrafish, hlístice, kuře, xenopus, myši jsou široce používaná zvířata.
Příklad transgeneze v myším modeluExogenní DNA se vstřikuje do mužského pronukleu:
Po jeho výrobě je protein čištěn pomocí biochemických metod, jako je sloupcová chromatografie, vysoce účinná kapalinová chromatografie atd.
Je možné, že počet kopií integrovaného transgenu je nedostatečný, aby umožnil produkci sledovaného proteinu v koncentraci uspokojivé pro jeho použití ve velkém měřítku.
Naopak exprese přeneseného genu může být tichá. Ve skutečnosti, pokud je tento integrován na úrovni oblasti heterochromatinu , gen nebude transkribován, a proto nebude exprimován.
Integrace transgenu může mít také škodlivé důsledky pro vývoj hostitelského organismu:
Antitrombin III je protein produkován v játrech a endotelových buňkách u lidí. Jeho úkolem je zabránit tvorbě krevních sraženin v žilách a tepnách. Snížené hladiny antitrombinu III představují riziko tromboembolické choroby . Nedostatky antitrombinu mohou vzniknout z vrozených problémů nebo mohou být získány po celý život. V dnešní době, s pokrokem vědy, je možné ji syntetizovat díky genetickému inženýrství.
Jak získat antitrombin III pomocí genetického inženýrství ?Nejprve musíme zvolit aktivní promotor v tkáních nebo žlázách, ve kterých chceme získat rekombinantní protein (zde kozí mléko). Tento promotér musí být klonován. Aby mohl být protein obsažen v mléce, musí být zavedená sekvence DNA složena z:
Jakmile je tento krok dokončen, provede se transgeneze, jak je popsáno výše. Nakonec je protein purifikován a poté uveden na trh (například pod názvem ATryn).
Tato technika umožňuje získat mnohem větší množství antitrombinu než v lidské krvi.
Existují dva způsoby podání této látky: