DNA čip je kolekce DNA molekul připojených uspořádány, na malé ploše, což může být sklo , křemík nebo plastu . Tato poslední biotechnologie umožňuje analyzovat úroveň exprese všech genů ( transkriptů ) v buňce , tkáni, orgán, organismus nebo i komplexní směs, v daném okamžiku a v daném stavu ve vztahu ke vzorku . reference.
DNA čipy se také nazývají genové čipy , biočipy nebo anglickými výrazy „ DNA chip, DNA-microarray, biochip “ . Francouzské výrazy DNA microarray a DNA microarray jsou také výrazy navržené Office québécois de la langue française .
Princip DNA čipu je založen na vlastnosti denaturované DNA (jednořetězcové) spontánního reformování své dvojité šroubovice, když je v přítomnosti komplementárního řetězce ( hybridizační reakce ). Čtyři nukleové báze DNA ( A , G , C , T ) skutečně mají zvláštnost párování dvou po dvou vodíkovými vazbami (A = T a T = A; G G C a C ≡ G).
Mluvíme o sondě (fragment syntetické DNA představující geny, jejichž expresi se snažíme studovat, kovalentně fixovanou k povrchu biočipu) a o cíli (mRNA, kterou se snažíme identifikovat a / nebo kvantifikovat (vzorek)). Cíle jsou fluorescenčně označeny (viz níže).
K měření / detekci RNA, které budou nebo nebudou přeloženy do proteinů, lze použít mikročipy. Vědci hovoří o expresní analýze nebo expresním profilu . Vzhledem k tomu, že je možné připojit až milion sond na biočip, představují DNA mikročipy masivní přístup a přispěly k revoluci v genomice , protože umožňují odhadnout na několik desítek tisíc v jediném experimentu. genů. Existuje však také velké množství různých aplikací, které zahrnují technologii DNA čipů (screening mutací, resekvenování, interakce DNA / protein, mikrobiální ekologie).
V praxi se celková RNA extrahuje ze studovaných buněk a někdy podstoupí amplifikaci, což umožní získat dostatečné množství genetického materiálu pro experiment. Tyto mRNA jsou poté transformovány na komplementární DNA (cDNA) technikou reverzní transkripce a značeny. Toto značení nyní poskytuje fluorescenční molekula ( fluorochrom ). Existují dva převážně používané fluorochromy: Cyanin 3 (Cy3), který fluoreskuje zeleně, a Cyanin 5 (Cy5), který fluoreskuje červeně. Takto označené cíle (cDNA) jsou poté uvedeny do kontaktu s čipem (nesoucím všechny sondy na jeho povrchu), tento krok se nazývá hybridizace. Každé vlákno cDNA pak hybridizuje se sondami, které jsou k němu komplementární, za vzniku dvouvláknového sondy / cílového duplexu. Biočip se poté promyje ve specifických lázních, aby se odstranily řetězce cDNA, které nehybridizovaly, protože nejsou komplementární se sondami fixovanými na podložním sklíčku. Biočip bude poté analyzován skenerem s velmi vysokým rozlišením na excitační vlnové délce cyaninu 3 nebo cyaninu 5. Naskenovaný obraz je poté analyzován počítačem, aby bylo možné přiřadit hodnotu d intenzitu každé sondě připojené k biočipu a tak určit zda došlo k hybridizaci pro každou sondu.
Během experimentu s biočipem DNA, jehož cílem je porovnat expresi genů mezi dvěma podmínkami (například: zdravá buňka versus nemocná buňka), jsou extrahovány celkové RNA dvou populací buněk a každá je označena jiným fluorochromem. Dva vzorky se poté ukládají současně na biočip, toto se nazývá kompetitivní hybridizace. Pokud je u daného genu počet molekul cDNA odpovídající tomuto genu v jednom stavu větší než v druhém, bude upřednostňována hybridizace mezi těmito cDNA a souvisejícími sondami. Po skenování biočipu ve dvou délkách dvou použitých fluorochromů je tedy možné porovnat intenzitu zeleného signálu s červeným signálem, a tedy vědět pro každý studovaný gen, za jakých podmínek je nejvíce exprimován.
Počátky DNA čipů začaly v roce 1991 publikací Stephena Fodora (americký vědec a zakladatel společnosti Affymetrix ) o technologii syntézy in situ . Poté přichází na řadu několik událostí:
Existují dva typy analýzy biočipů:
Jednou ze silných stránek jednokanálového biočipu je to, že aberantní vzorek neovlivňuje analýzu jiných vzorků. Naopak u dvoukanálových biočipů stačí jediný vzorek nekvalitní k drastickému snížení kvality výsledků, i když je druhý cílový vzorek dokonalý. Další silnou stránkou je, že data z jednokanálového biočipu jsou snadněji srovnávána s jinými biočipy z různých experimentů. Jednokanálový biočip je navíc někdy jediným možným řešením pro určité aplikace.
Následující tabulka je převzata ze stránky Wikipedia v angličtině .
| Název procesu nebo technologie | Popis |
|---|---|
| Genový výraz | Toto je nejznámější použití DNA čipu. Exprese genů se porovnává mezi různými danými podmínkami nebo v čase. Prostřednictvím hybridizace a následné analýzy obrazu tento proces identifikuje, které geny jsou za dané podmínky nadměrně nebo nedostatečně exprimovány. Jakmile jsou tyto geny identifikovány, jsou nezbytné další analýzy in silico, jako jsou shlukové analýzy, které spojují geny se stejným profilem exprese. Nakonec budou výsledky často potvrzovány gen po genu metodami, jako je kvantitativní PCR nebo Northern Blot. (metody genové analýzy) |
| Chromatinová imunoprecipitace | Biočipy mohou také využívat fenomén imunoprecipitace chromatinu (Chromatinová imunoprecipitace na čipu nebo ChIP-on-chip ). Tato metoda umožňuje určit umístění vazebného místa pro protein v genomu. |
| Polymorfismus | DNA čip také umožňuje detekovat polymorfismus, to znamená identifikovat bodové polymorfismy alel v populaci nebo mezi populacemi, předvídat vývoj nemocí v populaci, hodnotit mutace nebo analyzovat vazby mezi geny. |
| Obklady | Tyto čipy jsou určeny k hledání nových transkriptů (rozumí se tím termín „přepisovaný gen“). To znamená, že každý segment chromozomu (nejen známé geny) je zaměřen sondou. Jedním ze zájmů je objevit velké množství nekódujících RNA (například dlouhé nekódující RNA ). Je tedy možné úspěšně mapovat přepisy, hledat exony nebo dokonce hledat transkripční faktory . |
| Chimérický genový biočip | Existují také biočipy s chimérickým genem (nebo fúzním genem). Zásadou je alternativní sestřih v angličtině nebo alternativní sestřih ve francouzštině. Takový biočip pak může detekovat geny transkribované fúzí, tedy ze vzorků rakoviny. |
| Srovnávací genomová hybridizace | Komparativní genomová hybridizace čip je DNA čip používá pro analýzu změn v počtu kopií DNA. Tato technika se používá hlavně k diagnostice rakoviny a genetických chorob. |
| GeneID | Tyto čipy DNA se používají k detekci určitých typů organismů v potravinách (například GMO ), mykoplazmat v buněčné kultuře nebo určitých infekčních agens k diagnostice nemocí. Tato technika je založena hlavně na polymerázové řetězové reakci . |
Níže uvedený seznam nemá být vyčerpávající, ale poskytuje přehled oblastí použití biočipů.
Čip je sklíčko, obvykle vyrobené ze skla, přibližně malé velikosti (6 cm x 3 cm ), na kterém jsou připojeny sondy komplementární k cílenému fragmentu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA). K čipu lze připojit až milion sond, což umožňuje analýzu několika desítek nebo dokonce stovek tisíc genů.
Jaké typy sondy umístit na čip?
| Oligonukleotidy | Dlouhé sondy | |
|---|---|---|
| Střih | 15 - 70 moří | > 100 moří |
| Výhody | - Detekce SNP (polymorfismus)
- Dodáno „připraveno na místě“ |
- Necitlivý na alely / varianty
- Velké množství výroby - Dostupné sbírky (EST, BAC ...) - Dvouvláknové, více možností značení, lepší pokrytí genomu |
| Nevýhody | - Citlivé na alely / varianty
- Náklady na hromadnou výrobu - Návrh oligos je složitý krok |
- Nižší rozlišení
- Produkce produktů PCR je těžká - Problém křížové hybridizace - Chyby sbírek (EST) |
O jaké typy genů jde?
Sama o sobě neexistuje žádná kontraindikace týkající se typu testovaných genů (genů se známými nebo neznámými funkcemi). Nicméně, aby bylo možné odvodit spolehlivé informace z experimentů s biočipy, je vhodné zahrnout pozitivní a negativní kontrolní sondy, aby se ověřil a kontroloval správný postup každého kroku experimentu.
Tato metoda využívá dlouhé sondy (asi sto nukleotidů) uložené na podložním sklíčku. Sondy jsou syntetizovány před uložením na povrch v řadách drobných kapiček nebo skvrn (odtud anglický výraz microarray , „microtableau“). Používáme jemné jehly ovládané robotickým ramenem, které je ponořeno do skvrn. Jehly poté vstříknou přebytečné sondy do každého místa. Konečná „mřížka“ představuje profily nukleových kyselin připravených sond a každá sonda je připravena hybridizovat s cíli.
Tato metoda je nejjednodušší, díky čemuž je toto řešení přístupnější pro akademické laboratoře . Používají jej vědci a vědci z celého světa k výrobě správných čipů pro své potřeby. Čipy lze snadno přizpůsobit pro každý experiment, protože vědci si mohou zvolit typ a umístění sond nebo dokonce syntetizovat sondy samotné.
Vědci pak mohou generovat své vlastní cílové vzorky, které se používají k hybridizaci se sondami, aby konečně analyzovali čipy pomocí vlastního vybavení. To poskytuje čip, který je levnější (vyhýbá se nákladům na nákup komerčních čipů) a také vyhovuje jejich požadavkům.
Takto vyrobené čipy však nemohou mít stejnou hustotu sond jako čipy vyrobené in situ syntézou .
Tyto čipy se vyrábějí syntetizací malých sond DNA (<80 mer) přímo na nosiči (biočip) chemickou syntézou.
Obraz s vysokým rozlišením se získá pomocí skenerů s velmi vysokým rozlišením (řádově mikrometr), které odhalují interakce sonda / cíl excitací fluorochromů nesených cíli. Ve Francii společnost INNOPSYS vyvíjí, vyrábí a prodává kompletní řadu fluorescenčních skenerů určených pro čtení a analýzu tohoto typu podložních skel: InnoScan 710 (2 barvy, 3 µm / pixel, InnoScan 710-IR, InnoScan 910 (2 barvy) , 1 µm / pixel) a InnoScan 1100 (3 barvy, 0,5 µm / pixel).
Software interpretuje intenzitu pixelů v obrazu za účelem odvození digitálního měření exprese každého genu.
Analýzou DNA čipu se generuje velké množství dat a k interpretaci výsledků experimentu se používá mnoho technik. Mezi tyto techniky patří: