Fluorescenční mikroskopie (nebo epifluorescenčním ) je technika, pomocí optického mikroskopu s využitím jevu fluorescence a fosforescence místo, nebo navíc k běžným pozorování odrazu nebo absorpce z přírodního nebo umělého viditelného světla.
Můžeme tak pozorovat různé předměty, látky (organické nebo anorganické) nebo vzorky mrtvých nebo živých organismů.
Nyní je součástí klasických výzkumných metod a biologie a nadále se vyvíjí pomocí molekulárního zobrazování .
Fluorescence je vlastnost ovládaný některých subjektů vyzařovat světlo po absorbování vyšší energetické fotony. Fluorescenční mikroskopie je založena na tvorbě obrazu detekcí tohoto emitovaného světla. Posun Stokes popisuje rozdíl mezi vlnové délky absorbované délkou objektu (emitovaného světelným zdrojem mikroskopu), a emitovaného objektu. Čím větší je rozdíl mezi těmito dvěma vlnovými délkami, tím snazší je pozorovat fluorescenci.
Ve fluorescenci se rozlišují dva typy objektů:
Ve fluorescenční mikroskopii je proto možné přímo vizualizovat fluorescenční látky. U nefluorescenčních látek, buněk, molekul je nutné je označit látkami zvanými fluorochromy, jako je DAPI, které značí DNA a fluoreskují modře.
Určité genetické markery, jako je zelený fluorescenční protein (anglicky Green Fluorescent Protein nebo GFP), se také v biologii široce používají u geneticky modifikovaných organismů k jejich endogenní produkci . V tomto případě je fluorochrom bílkovina produkovaná přímo buňkou samotnou a nevyžaduje přidání substrátu. Fluorescence pak může být vizualizována přímo v živých buňkách, toto je jedno z polí vyvinutých molekulárním zobrazováním .
Lze použít mnoho technik značení:
Fluorescenční látky mohou být excitovány jednofotonovou excitací. K tomu se používá excitační světlo, jehož vlnová délka přímo excituje fluorofor. Proto je emitované fluorescence může pocházet z celé tloušťky vzorku křižuje excitačního svazku. Klíčovým prvkem tohoto konfokálního mikroskopu je pak „okno“ (dírka nebo konfokální duhovka) umístěné před detektorem, které eliminuje fluorescenci z nefokálních oblastí. Pozorování fluorescenčních signálů je založeno na pěti prvcích:
Tato excitace spočívá v téměř současné absorpci několika excitačních fotonů o vlnové délce blízké násobku optimální excitace na jednom fotonu. K tomu se používá pulzní laser na frekvencích blízkých infračervenému záření. V tomto případě je budičem pouze ohnisko laserového paprsku (dostatečná hustota fotonu pro spojení excitační energie). Aplikace se často omezují na dvoufotonovou mikroskopii (excitace fluoroforu dvěma fotony).
Tento systém je považován za důležitý technologický vývoj ze tří hlavních důvodů:
V praxi je účinnost fluorescenční emise méně dobrá než u konfokálu s jedním fotonem a poměr signál / šum je nižší. Ukazuje tedy malou výhodu pro pozorování kultivovaných buněk nebo řezů tkáně ( tloušťky 50-70 um ).
Tato technika se přirozeně používá pro simultánní excitaci několika fluoroforů s různými emisními spektry.
Varianta této techniky je fluorescenční mikroskopie pomocí multifokální excitace více fotonů . Princip je identický, ale laserový paprsek je rozdělen na několik paprsků, což umožňuje současně skenovat několik bodů. To umožňuje zkrátit dobu pořízení snímků.
Fluorescenční techniky lze použít s různými typy mikroskopů:
Tato zařízení mají v závislosti na výrobci vyměnitelné části ve tvaru krychle uspořádané na otočné hlavě nebo na vytahovacím jazýčku.
Tyto „kostky“ filtrují světlo směřující k objektivu a směrem k pozorovateli nebo senzoru podle hledaných fluorescencí.
Zahrnují 2 filtry a určité zrcadlo, „dichroické“, které odráží určité vlnové délky a které protínají ostatní.
Směrem ke zdroji je budicí filtr.
Na straně pozorovatele je bariérový filtr.
Kostky jsou uvedeny podle excitačních světel: ultrafialové, fialové, modré, zelené ...
Tato technika se používá zejména ke sledování lipidových monovrstev, ke kterým byla přidána fluorescenční lipidová sonda. Fluorescence je pozorována v závislosti na fázi, ve které se nachází hlavní lipid. Obecně je sonda rozpustná ve fázi expandované kapalinou (LE), ale ne v plynné (G) nebo pevné (S) fázi. To umožňuje pozorovat makrostruktury tvořené monovrstvou. Naproti tomu lipidová monovrstva v rovnováze je pozorována epifluorescenční mikroskopií . Fluorescenční lipidová sonda je rozpustná ve fázi LE, ale ne ve fázi G. Výsledkem je, že pozorujeme v rovnováze druhy bublin (ale „bublina“ je trojrozměrný koncept), jejichž stěny jsou tvořeny. lipid ve fázi LE a vnitřek ve fázi G. Vezmeme-li trojrozměrný příklad, bylo by to jako brát mýdlovou pěnu a krájet její velmi tenký plátek.
Epifluorescenční zobrazování tří složek dělící se lidské rakovinné buňky. DNA se objeví modrá, je protein nazvaný INCENP zobrazí zeleně a mikrotubuly červeně. Každý fluorofor byl zobrazen samostatně, se specifickou excitační vlnovou délkou a filtry, poté byl z fotografií pořízených CCD kamerou překomponován obraz .
Endotelové buňky skotské plicní tepny (jádra obarvená modře pomocí DAPI, mikrotubuly značené zeleně s protilátkou vázanou na FITC a aktinová vlákna označená červeně phalloidinem vázaným na protein TRITC).
Lidské jádro lymfocytů obarvené DAPI s chromozomy 13 (zelená) a 21 (červená) sondami hybridizovanými na centromery ( hybridizace in situ ve fluorescenci ).
Kvasinková buněčná membrána , demonstrace struktury (žlutě) získané fúzí membránových proteinů se dvěma fluorescenčními markery (RFP a GFP).
Detekce molekuly YFP v lidské rakovinné buňce v nanometrickém měřítku.
Jádro buňky rakoviny kostí (technika zvaná dvoubarevná lokalizační mikroskopie nebo 2CLM pro anglicky mluvící). Obrázek získaný fluorescencí markerů fúzovaných s proteiny GFP a RFP pro 120 000 molekul lokalizovaných v omezené oblasti (470 umm 2 ).