V molekulární biologii je morfolino typ molekuly používané ke změně genové exprese . Morfolino oligonukleotidová technologie je antisense technologie používaná k blokování přístupu jiných molekul ke specifickým sekvencím určitých molekul nukleových kyselin . Mohou blokovat přístup dalších molekul do malých oblastí (asi 25 bází) povrchu párování bází ribonukleových kyselin (RNA). Morpholinos jsou někdy označovány názvem PMO , anglická zkratka znamená fosforodiamidát morfolino oligo . Slovo „morfolino“ se může objevit v jiných chemických názvech. Týká se to chemikálií obsahujících morfolinový kruh se šesti podjednotkami; tento článek pojednává pouze o morfolino antisense oligonukleotidech.
V biologickém výzkumu, morfolina jsou obvykle používány jako nástroje pro reverzní genetiky tím inaktivaci funkce genu. Toho je dosaženo zabráněním buňkám v syntéze cílového proteinu nebo změnou sestřihu pre-mRNA . Inaktivace genové exprese je výkonná metoda pro studium funkce konkrétního proteinu. Podobně indukce sestřihu specifického exonu může pomoci určit funkci části proteinu kódovaného tímto exonem. Tyto molekuly byly použity ke studiu několika modelových organismů, včetně myší , zebrafish a xenopus .
Morfolinos se také vyvíjí jako farmaceutická terapie zaměřená proti patogenním organismům, jako jsou bakterie nebo viry, a ke zlepšení léčby proti genetickým chorobám . Tyto syntetické oligonukleotidy navrhl Dr. James E. Summerton ( Gene Tools , LLC) a byly vyvinuty ve spolupráci s Dr. Dwightem D. Wellerem ( AVI BioPharma Inc. ).
Morpholinos jsou syntetické molekuly, které jsou výsledkem přeskupení přirozené struktury nukleových kyselin. Obvykle o délce 25 bází se vážou na komplementární sekvence RNA párováním bází . Strukturálně, i když morfoliny mají klasické dusíkové báze, liší se od DNA v tom, že tyto dusíkové báze jsou připojeny k morfolinovým kruhům namísto deoxyribózy . Tyto morfolinové kruhy jsou spojeny dohromady fosforodiamidátovými skupinami místo fosfátových skupin . Je snazší si to představit odkazem na obrázek 1 a porovnáním struktur RNA řetězce a morfolino řetězce. Nahrazení aniontových fosfátových skupin nenabitými fosforodiamidátovými skupinami eliminuje ionizaci v obvyklém fyziologickém rozmezí pH, takže morfolina v organismech nebo buňkách jsou nenabité molekuly. Celá páteř morfolina je tvořena těmito upravenými podjednotkami. Morfolinos se nejčastěji používají jako jednovláknové oligonukleotidy, takže heteroduplexy vytvořené z morfolinového řetězce a komplementární DNA lze použít v kombinaci s dodáním kationtových cytosolických činidel .
Na rozdíl od mnoha antisense strukturních typů, jako jsou fosforothioáty nebo malé interferující RNA, morfoliny nedegradují molekuly RNA, ke kterým se připojují. Morpholinos působí stérickou zábranou tím, že se připojují ke své cílové sekvenci na RNA, brání molekulám, které v jejich nepřítomnosti interagují s RNA.
Morfolino oligonukleotidy se často používají ke zkoumání role specifické mRNA transkribované v embryu. Vývojoví biologové injikují morfolino oligonukleotidy do vajíček nebo embryí zebrafish , xenopus , kuřat a mořského ježka, čímž produkují morfantní embrya . S vhodným cytoplazmatickým přenosovým systémem se morfoliny účinně používají v buněčné kultuře .
Morpholinos jsou vyvíjena jako léčiva pod názvem „ NeuGene “ společností AVI BioPharma Inc. Používají se u savců od myší až po člověka a některá jsou běžně testována v klinických studiích jako léčba, protinádorová léčba nebo léčba Duchennova svalová dystrofie.
V eukaryotických organismů , pre-mRNA je transkribována do jádra, introny jsou spojeny , a potom zralé mRNA je exportována z jádra do cytoplazmy . Malé ribozomové podjednotky obvykle začínají navázáním na jeden konec mRNA a jsou zde spojeny různými iniciačními faktory , čímž tvoří iniciační komplex. Iniciační komplex prochází řetězcem mRNA, dokud nenarazí na iniciační kodon , kdy se velká podjednotka ribozomu připojí k malé podjednotce. Překlad tohoto proteinu začíná. Celý tento proces se označuje jako genová exprese. Jedná se o proces, při kterém se informace o genu kódovaném posloupností dusíkatých bází v DNA převádí na proteinovou strukturu. Morfolino může modifikovat sestřih nebo blokovat překlad v závislosti na základní sekvenci morfolina.
Navázané na 5 'nepřekládanou oblast messengerové RNA (mRNA) mohou morfolinos interferovat s progresí ribozomálního iniciačního komplexu z 5' čepičky do iniciačního kodonu. Tato inaktivace z genové exprese brání translaci kódující oblasti cílené transkriptu . To je užitečné z experimentálního hlediska, když si výzkumník přeje znát funkci konkrétního proteinu. Morfolinos poskytují pohodlný způsob inaktivace exprese cílového proteinu a studium toho, jak inaktivace mění buňku nebo organismus. Některá morfolina inaktivují expresi tak účinně, že po degradaci již existujících proteinů se cílové proteiny stanou nedetekovatelnými elektrotransferem .
Morfolinos může interferovat s fázemi zpracování pre-mRNA , buď zabráněním páření malého nukleárního ribonukleoproteinového komplexu ( snRNP ) s jejich cíli na okraji intronů na vláknu pre-mRNA, nebo blokováním nukleofilních adeninů , čímž zabrání tvorbě sestřihu lasových struktur nebo interferencí s připojením regulačních spojovacích proteinů, jako jsou „tlumiče sestřihu“ a „ zesilovače sestřihu “. Zabránění připojení U1 (v dárcovském místě) nebo U2 / U5 (polovina na polypyrimidinu a polovina na akceptorové místo) snRNP mohou způsobit sestřihové změny , obvykle vyloučení exonů z maturace mRNA. Cílení na určité spojovací cíle vede k vyloučení intronu , zatímco aktivace skrytých spojovacích míst může vést k částečnému začlenění nebo vyloučení. Cíle komplexů snRNP U11 / U12 lze také blokovat. Modifikace sestřihu může být ověřena reverzní transkripční polymerázovou řetězovou reakcí ( RT-PCR ) a projevuje se v elektroforetickém gelu vytěsněním pásu produktu RT-PCR.
Morfolinos se používá k blokování aktivity mikroRNA a k blokování aktivity ribozymů . Funkce UR2 a U12 snRNP byly inhibovány morfoliny. Morfolinos cílení posuvných sekvencí mRNA v kódujících oblastech může vyvolat posun čtecího rámce . Aktivity morfolinosů proti této řadě cílů naznačují, že morfolinos lze použít jako univerzální nástroje k blokování interakcí proteinů nebo nukleových kyselin s mRNA.
Gene Tools, LLC a AVI BioPharma Inc. jsou společnosti, které se domáhají práv duševního vlastnictví v různých aspektech morfolino oligonukleotidů.