Tyto monoklonální protilátky jsou protilátky přirozeně produkované téže aktivovaných B buněk nebo plazmatických buňkách , rozpoznávající stejný epitop antigenu.
Aby bylo možné je použít jako terapii, jsou produkovány díky buňce vzniklé fúzí mezi lymfocytem B a rakovinnou buňkou ( myelomem ) zvanou hybridom .
Během 70. let bylo známo, že rakovina ( myelom ) B buněk produkuje velké množství identických protilátek . V roce 1975 Georges Köhler a César Milstein publikovali v Nature techniku produkce monoklonálních protilátek. V roce 1984 jim byla za tento objev udělena Nobelova cena za medicínu . V roce 1988 založil Greg Winter první techniky humanizace monoklonálních protilátek, které připravily půdu pro jejich lékařské použití.
Za účelem produkce stabilních linií buněk produkujících požadovanou protilátku vymysleli Kohler a Milstein myšlenku a způsob fúze dvou typů buněk. Tím, že kompenzuje neschopnost B buněk (které produkují protilátky) reprodukovat fúzí s myelomy (nesmrtelné rakovinné buňky), je získán hybridom, který vylučuje protilátky a má tu vlastnost, že se množí donekonečna.
K získání monoklonálních protilátek je zapotřebí několik kroků.
ImunizaceJedná se o očkování (1), obvykle peritoneálně , antigenu nebo haptenu u laboratorního zvířete (často druh , nejčastěji myš , potkan nebo králík ), jehož účinkem je produkce plazmatických buněk uvolňujících protilátky proti tomuto antigenu. K boji proti antigenu se vyrábějí různé protilátky ( polyklonální ). Je možné získat protilátky, které rozpoznávají látky, které nejsou imunogenní, jejich konjugací s imunogenními proteiny , jako jsou BSA , KLH nebo DNP . Je možné provést několik imunizačních protokolů změnou dávek, intervalů injekcí, použitého adjuvans a délky léčby. Používané adjuvans je hlavně Freundovo adjuvans, buď neúplné (emulze olejů, vody a emulgátorů - mýdla - které zachycují stříbro), nebo úplné (komplex vody, olejů, emulgátorů a kousků usmrcených bakterií). Tato injekce má za následek produkci plazmatických buněk uvolňujících polyklonální protilátky proti tomuto antigenu. Způsoby působení adjuvans ve vakcínových přípravcích jsou dvou typů:
Potom je zvíře usmrceno a B buňky jsou izolovány ze sleziny (2). Ty, které se nemohou množit, ale produkují požadované protilátky, jsou fúzovány (4) s myelomy (rakovinné buňky, proto schopné rychlého dělení buněk a nesmrtelné). Tento krok tavení lze provést pomocí PEG nebo elektroporací . Tyto buňky se poté umístí do kultury ; protože tyto hybridomy mají vlastnost rakovinných buněk, množí se rychle a neurčitě.
Šíření, výběr a klonováníMyelomové buňky použité pro fúzi neprodukují protilátky ani žádný z protilátkových řetězců. Kromě toho tyto buňky ztratily ( genetickou selekcí ) schopnost produkovat enzym zvaný hypoxanthin-guanin fosforibosyltransferáza (HGPRT). Tento enzym se podílí na syntéze nukleotidů , zejména na záchranné cestě (na rozdíl od cesty de novo ). Výběr fúzovaných buněk se provádí chemickými sloučeninami hypoxanthin , aminopterin a thymidin ( médium HAT ). Aminopterin blokováním de novo syntézy nukleotidů nutí buňky používat záchranné lano. Protože mateřské myelomy nemají esenciální enzym, budou schopny přežít pouze buňky fúzované se splenocyty a takto získané. Hypoxanthin a thymidin jsou substráty této záchranné linie. Na druhé straně se nefúzované B buňky samy eliminují a nejsou schopné se reprodukovat. Po období selekce v médiu HAT se hybridomy vyvinuly do kolonií . Míra úspěšnosti fúze je poměrně nízká a liší se podle použitého protokolu (od 5% do 50% ). Za účelem podpory růstu těchto hybridomů lze do kultivačního média přidat několik přísad ( FBS , růstový faktor , vrstva podpůrných buněk). Tyto hybridomové linie vylučují všechny různé protilátky. Abychom vybrali požadovanou protilátku, musíme nejprve izolovat každý z klonů (5). Obvykle se tato selekce provádí omezením ředění, aby se umožnila izolace jedinečných klonů. V poslední době umožňuje použití průtokového cytometru také separaci buněk. Po druhém kole kultivace je potom každý klon testován, většinu času Western blotem , ELISA nebo RIA , aby se ověřila jeho schopnost vázat antigen nebo hapten použitý pro imunizaci. Vylučované protilátky se poté testují, aby se vyloučily ty, které indukují křížové reakce s jinými antigeny.
VýrobaPo selekci se produkce šarží protilátek provádí přečištěním biologického média obsahujícího protilátku v roztoku, přičemž druhým je buď ascites produkovaný u zvířete (tj. Intravenózní injekce. Peritoneální hybridom připravený u zvířete -) (7b), nebo supernatant z buněčné kultury použit pro růst hybridomu in vitro (7a). V závislosti na požadované velikosti může výroba buněčné suspenze probíhat v bioreaktorech . Skutečné čištění lze provést různými způsoby, například vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií , afinitou k proteinu G nebo srážením amoniem.
Jakmile byl získán hybridomový klon vylučující protilátku požadované specificity , bude charakterizován, aby byla známa třída imunoglobulinových řetězců, její afinita nebo rozpoznaný epitop ( mapování epitopu ). Je možné určit sekvenci DNA z genu imunoglobulinů tohoto klonu z subklon a upravit. To umožňuje produkovat chimérické protilátky (léky s příponou -ximab, „mab“ pro Monoclonal AntiBody) nebo humanizované (přípona -zumab), nebo dokonce produkovat pouze fragment Fab protilátky rozpoznávající antigen.
Aplikace se liší od laboratorního použití po klinické použití. Monoklonální protilátky mají mnohostranné použití ve výzkumu a diagnostice, klinické i humánní a zvířecí, využívají rozpoznávání proteinů v biologii, nebo mohou být použity jako léky proti osteoartritidě ( některé příklady léků ).
Podávání se provádí parenterálně ( intravenózně , subkutánně nebo intramuskulárně ). Monoklonální protilátky difundují do celého těla, ale nepřekračují hematoencefalickou bariéru .
Eliminace probíhá buď po navázání na cílový antigen ( endocytóza komplexu protilátka-antigen a degradace lysozomy ), nebo nespecificky retikuloendoteliálním systémem .
Jsou dvou typů: buď specifické, kvůli inhibici cíleného antigenu, nebo nespecifické, kvůli samotné protilátce. V druhém případě to mohou být alergické reakce, nesnášenlivost v místě vpichu. Alergické reakce jsou méně v případě humanizovaných protilátek.
Mezi vedlejší účinky těchto produktů patří případ přípravku Raptiva vyráběného společností Genentech, Inc., (efalizumab) schválený v roce 2003 ve Spojených státech, jako injekční léčivo podávané jednou týdně k léčbě psoriázy u dospělých. Raptiva, humanizovaná monoklonální protilátka se selektivním imunosupresivním účinkem, byla předepsána k léčbě dospělých pacientů s intolerantní psoriázou s plaky nebo kteří jsou kontraindikováni k jiné systémové léčbě, jako je léčba cyklosporinem, methotrexátem nebo PUVA. Je podezřelý ze spouštění progresivní multifokální zánětlivé polyradikuloneuropatie, včetně případů Guillain-Barreova syndromu, buffy encefalopatií . The16. října 2008„ Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) zdůrazňuje rizika následujících potenciálně smrtelných infekcí: bakteriální infekce, virová meningitida , generalizovaná fungální infekce, progresivní multifokální leukoencefalopatie (PML). Autorizovaný v Evropě v roce 2004, uvedený na trh v roce 2005, byl z trhu stažen v roce 2009.