Protilátka je komplexní glykoprotein podle používá adaptivní imunitní systém pro specifickou detekci a neutralizaci patogeny . Protilátky jsou vylučovány plazmatickými buňkami , což je poslední stupeň diferenciace B lymfocytů .
Protilátky specifické pro konkrétní mikrob jsou G, A a E, protože jejich sekrece závisí na aktivaci CD4 T lymfocytů .
Protilátky jsou hlavním imunoglobulinem v krvi. Někdy se místo slova protilátka používá termín imunoglobulin , ale toto použití je zneužíváno.
Tyto antigeny a protilátky, kombinace je základem imunitní reakce organismu proti vnějším prostředkem, nemají definici samy o sobě, ale jsou definovány vzhledem k druhé:
Jakákoli cizí látka nebo jakýkoli mikrob zavedený do těla se tedy může chovat jako antigen, to znamená způsobit produkci speciálních proteinů, protilátek, které mají schopnost neutralizovat škodlivé účinky cizí látky nebo mikrobu a toxiny, které produkují. Tím se tělo stává odolným vůči invazní látce: stává se imunním.
V případě autoimunitního onemocnění mluvíme o autoprotilátkách .
Obecnou strukturu protilátek popsal v roce 1959 Porter po práci Edelmana. Tyto dva výzkumníci byly spojeny pro Nobelovy ceny v roce 1972. Tyto protilátky jsou glykoproteiny z imunoglobulinové superrodiny vytvořené ze 4 polypeptidových řetězců (150000 amu nebo daltonů), dva těžké řetězce ( H pro těžkých 50,000 amu , každá v purpurové na obr. 1) a dva lehké řetězce ( L pro světlo 25 000 amu každý, zeleně), které jsou navzájem spojeny různým počtem disulfidových můstků (červeně) zajišťujících flexibilitu molekuly. Tyto řetězce tvoří strukturu Y (polovina každého lehkého řetězce tvoří rameno Y) a jsou tvořeny imunoglobulinovými doménami přibližně 110 aminokyselin . Každý lehký řetězec se skládá z konstantní domény a variabilní domény; těžké řetězce jsou složeny z variabilního fragmentu a tří nebo čtyř konstantních fragmentů v závislosti na izotypu . Pro danou protilátku jsou dva těžké řetězce identické, stejně jako dva lehké řetězce.
Konstantní domény jsou charakterizovány aminokyselinovou sekvencí velmi blízkou jedné protilátce k druhé, která je charakteristická pro daný druh a izotyp. Každý lehký řetězec má kopii označený C L . Těžké řetězce obsahují v závislosti na izotypu tři nebo čtyři konstantní domény CH1 , CH2 , CH3 , ( CH4 ).
Konstantní domény se nepodílejí na rozpoznávání antigenu, ale zasahují do aktivace systému komplementu i do eliminace imunitních komplexů (protilátka navázaná na svůj antigen) imunitními buňkami, které mají receptory pro konstantní fragmenty. ( RFc ).
Protilátka má čtyři variabilní domény umístěné na koncích dvou „ramen“. Spojení mezi variabilní doménou nesenou těžkým řetězcem ( VH ) a sousední variabilní doménou nesenou lehkým řetězcem ( VL ) tvoří rozpoznávací místo (nebo paratop ) antigenu. Molekula imunoglobulinu má tedy dvě vazebná místa pro antigen, jedno na konci každého ramene. Tato dvě místa jsou identická (ale určená pro různé epitopy ), proto existuje možnost vázat dvě molekuly antigenu na protilátku.
Specifické enzymatické štěpení umožňuje izolovat různé fragmenty:
To je Jacques Oudin , který v roce 1956 vytvořil tři slova: izotyp a alotypie idiotypie, které nyní používá celá vědecká komunita a vyjadřují nekonečnou možnost přizpůsobení našeho imunitního systému.
Protilátky (historicky nazývané „Ig“, protože byly použity k definici termínu „ imunoglobulin “) se dělí do tříd nebo „izotypů“ podle struktury konstantních domén těžkých řetězců: řetězce γ, α, μ, ε a 5 odpovídají příslušně imunoglobulinům IgG, IgA, IgM, IgE a IgD (viz tabulka 1 ). Existují také podtřídy imunoglobulinů, které odrážejí jemnější rozdíly mezi těžkými řetězci. Lidská bytost má tedy čtyři podtřídy IgG a dvě podtřídy IgA. Existují také izotypy lehkého řetězce, které mohou být κ (kappa) nebo λ (lambda). Izotypie se používá k vytváření tříd a podtříd.
| IgG | IgA | IgM | IgE | IgD | |
| Umístění
membrána |
Ano | Ano | Ano | Ano | Ano |
| Vylučování | Ano | Ano
Monomer nebo dimer |
Ano pentamer | Ano | Ne |
| Valencie 1 | 2 | 2 až 4 | 2 až 10 | 2 | 2 |
| Umístění | krev |
slizniční sekrece |
Krevní B lymfocyt |
Bazofilní granulocyty žírných buněk |
B lymfocyt |
| Podíl | 70% až 75% | 15% až 20% sérových protilátek |
10% | méně než 1% | méně než 1% |
| Role | neutralizace toxinů , bakterií a virů , klasická cesta komplementu (kromě IgG4) | aglutinace, neutralizace bakterií , virů |
aglutinace, klasická cesta komplementu |
alergie , neutralizace parazitů |
aktivace B lymfocytů |
Tabulka 1: Vlastnosti různých izotypů imunoglobulinu.
Valence IgM 10 je pouze teoretická. Ve skutečnosti, i když tento izotyp protilátky má pentamerní strukturu, sterické nepohodlí způsobené během vazby na epitopy antigenů způsobuje, že skutečná valence je blíže 5 nebo dokonce 6.
Alotypii proteinů objevil a pojmenoval v roce 1956 Jacques Oudin . Dříve se předpokládalo, že všichni jedinci stejného živočišného druhu mají stejnou antigenní specificitu (nazval ji tehdy izotypovou specificitou). Ukázal, že antigenní (alotypové) specificity se liší podle skupin jedinců stejného druhu a jsou přenášeny dědičně podle Mendelových zákonů.
Bylo to v roce 1956, kdy Grubb a Laurell objevili systém Gm, skupinový systém IgG imunoglobulinů, technikou antiglobulinové inhibice . Tento systém tvoří různé alotypy těžkých řetězců. Umožňuje také diferenciaci molekul čtyř podtříd, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
C. Ropartz a kol. v roce 1961 objevili systém Km (původně nazývaný Inv), nesený lehkým řetězcem Kappa, tento alotyp je proto přítomen na všech třídách imunoglobulinů.
A konečně, systém ISF umístěný na yy těžkém řetězci IgG1, exprese této specificity stoupá s věkem, z 25% subjektů před 20 lety na 60% po 70 letech, na bělochů.
Alotypy definované systémem Am se nacházejí na IgA a přesněji na řetězcích α2. Existují dva izotypy α1 a α2 řetězců α, charakterizující podtřídy Am1 a Am2 IgA.
Idiotyp protilátek byl objeven a pojmenován v roce 1963 Jacquesem Oudinem pozorováním, že protilátky mají jiné antigenní specificity než alotypové specificity a jsou zjevně spojeny s funkcí protilátky. Poznamenal, že některá antiséra rozpoznávala pouze protilátky, které byly použity k jejich přípravě ... Protilátky tedy měly antigenní specificity zjevně spojené s jejich funkcí kombinace s antigenem a se svou specificitou 1 . Imunitní systém jedince, který produkuje protilátky, je schopen za nepatologických podmínek reagovat na jeho idiotypové specificity a přispívat tak k regulaci jejich produkce.
Idiotyp je paratop specifický pro molekulu, vyplývající z jednoho klonu . Tento epitop je součástí místa pro rozpoznávání antigenu nebo je mu velmi blízký, a proto se nachází na variabilní části imunoglobulinu Fab ( fragment vázající antigen ). Jinými slovy, paratop nebo jeho sousední oblast imunoglobulinu lze určitými lymfocyty rozpoznat jako epitop. Proto je pojem idiotypické sítě.
Během imunitní odpovědi mají protilátky tři hlavní funkce: vazbu na antigen, aktivaci systému komplementu a nábor imunokompetentních buněk.
Protilátky mají schopnost rozpoznávat a specificky se vázat na antigen. Tato specificita je dána přítomností extrémně variabilních domén na koncích protilátek. Rozpoznání mezi antigenem a protilátkou se například používá v boji proti bakteriálním toxinům. Tyto toxiny fungují tak, že se připojují k receptorům přítomným na povrchu buněk těla, což způsobuje významné narušení buněčné aktivity. Navázáním na tyto toxiny je anti-toxinové protilátky neutralizují a zabraňují vazbě na buněčné receptory (viz obrázek 2).
Stejně tak mnoho virů a bakterií projevuje svoji patogenitu až po připojení k buňkám těla. Bakterie používají adhesiny, které jsou adhezivními molekulami k buněčným membránám, a viry mají na svém vnějším obalu vazebné proteiny. Anti-adheziny a protilátky proti proteinu virové kapsidy blokují působení těchto patogenů vazbou na vazebné molekuly.
Protilátky také chrání tělo spuštěním kaskády komplementu . Jedná se o soubor plazmatických proteinů, jejichž aktivace (klasickým způsobem v případě protilátek) ničí bakterie perforací a usnadňuje fagocytózu , eliminaci imunitních komplexů a uvolňování chemotaktických molekul . Což vede k lýze patogenního prvku. Tyto sérové proteiny zprostředkovávají zánět.
Po rozpoznání antigenu podle jeho variabilní části se protilátka může vázat na buňky imunitního systému prostřednictvím své konstantní části. Tyto interakce mají v průběhu imunitní odpovědi velký význam. Protilátky připojené k bakterii se tedy mohou vázat na makrofágy a vyvolat fagocytózu. Tyto NK buňky ( Natural Killer ) mohou mít jejich cytotoxicitu a lyžovaly bakterie opsonizované protilátkami.
Protilátky jsou kódovány geny, které procházejí rekombinací V (D) J v plazmatických buňkách (což jsou B buňky ). Tato rekombinace je ve spojení s jevy somatické hypermutace a junkční variability zdrojem jejich rozmanitosti.
Ig M se nevytváří po aktivaci B lymfocytů.
Jak B lymfocyt dozrává, a v závislosti na podnětech, které doprovázely toto zrání, procházejí klony B buněk rozpoznávající epitop přepínání tříd. Zralé B buňky, které v zásadě exprimují pouze IgM a IgD, se mohou vyvinout tak, aby produkovaly pouze jediný izotyp (IgE, IgA a IgG), provedením rekombinace genu kódujícího těžké řetězce s konstantní fragmentem (Fc), ale udržením variabilní fragment neporušený. Tato neustálá změna fragmentu se také a častěji označuje jako izotypové přepínání.
Tento jev je možný uspořádáním genů kódujících CH domény: na genomu jsou genové segmenty kódující izotyp postupné a předchází jim přepínací sekvence. Po přijetí extracelulárního přepínacího signálu syntetizuje B lymfocyt rekombinázu, která vytváří nefunkční smyčku mezi přepínacími sekvencemi: tato smyčka spojuje segment kódující konstantní doménu a již vytvořenou asociaci VDJ.
Příklad: Produkce interleukinu 4 +++ také IL13 lymfocytem Th2 vede k izotypickému přechodu z IgM na IgE.
Patogen ( bakterie , virus atd.) Je imunním systémem rozpoznán prostřednictvím antigenů . Antigen má obecně několik různých epitopů, což jsou všechna vazebná místa pro protilátky. Populaci protilátek lze klasifikovat podle její schopnosti rozpoznávat jeden nebo více epitopů. Mluvíme pak o monoklonálních a polyklonálních protilátkách.
Monoklonální protilátky jsou protilátky, které rozpoznávají pouze jeden typ epitopu na daném antigenu (viz obr. 3). Podle definice jsou všechny identické a produkovány jediným klonem plazmatických buněk .
Monoklonální protilátky jsou široce používány v biologii a medicíně , a to jak jako diagnostické nástroje, tak pro terapeutické účely . Všechny monoklonální protilátky používané jako léky mají INN končící na „mab“, což je zkratka pro „ monoklonální protilátku “, například rituximab . Jsou například používány v komerčních těhotenské testy , stejně jako v mnoha oblastech výzkumu v biologii a mnoho technik ( průtoková cytometrie , Western bloty, atd.). Stále častěji se používají v laboratorních imunohematologických testech ke zvýšení pozitivních reakcí.
Produkce monoklonálních protilátek in vitro je již dlouho obtížná kvůli krátké životnosti buněk vylučujících protilátky, plazmatických buněk. Protilátky pak byly získány in vivo injekcí zvířete daným antigenem a odběrem protilátek v jeho krvi. Tato drahá metoda poskytla pouze malé množství protilátek znečištěných mnoha nečistotami.
Na konci 1970 , César Milstein a Georges Köhler vyvinuli techniku hybridomu . Antigen je injikován do zvířete a buňky sleziny jsou z něj odstraněny po několika týdnech. V těchto buňkách se nacházejí plazmatické buňky vylučující protilátky namířené specificky proti zvolenému antigenu. Tyto plazmatické buňky jsou poté fúzovány in vitro s myelomy , což jsou nádorové buňky, které mají tu vlastnost, že se neomezeně množí. Získané hybridní buňky (nazývané „hybridomy“ ) se vyberou a poté se množí ve vhodném kultivačním médiu. Produkují tam monoklonální protilátky, velmi čisté a ve velkém množství.
Genetického inženýrství dnes mohou produkovat monoklonální protilátky pro použití v humánní klinické praxi. Ale většina protilátek produkovaných v buňkách hlodavců ( myš , potkan , křeček , králík vzácněji kuře , parmice ) vyvolávají imunitní reakci, když jsou injekčně podány pacientovi. Tato neaktivní imunita postupně snižuje prospěšné působení protilátky. Aby se tomu zabránilo, jsou prováděny pokusy o produkci „humanizovaných“ chimérických protilátek, modifikovaných genetickým inženýrstvím tak, aby byly co nejvíce nahrazeny konstantní Fc fragmenty původního druhu lidskými fragmenty.
Například v případě pandemie ( ptačí chřipky ) je pasivní imunoterapie pacientů s monoklonálními protilátkami jedním z řešení zvažovaných výzkumníky, kteří již v roce 2007 testovali její účinnost na zvířatech, přičemž výsledky naznačují, že protilátky monoklonální léky lidského původu mohly být vyrobeny z krve pacientů, kteří se zotavili z chřipky H5N1 (nebo případně rekonvalescentů) a pomáhají zastavit epidemii a omezit počet úmrtí (jako jediná profylaxe nebo jako další léčba).
Polyklonální protilátky jsou směsí protilátek, které rozpoznávají různé epitopy na daném antigenu, přičemž každý idiotyp je vylučován jiným klonem plazmatických buněk . Během imunitní odpovědi organismus syntetizuje protilátky namířené proti několika epitopům antigenu: odpověď se nazývá polyklonální. In vivo je reakce vždy polyklonální, s výjimkou výjimečných případů ( například očkování ). Tento příklad je ve skutečnosti příkladem monospecifické polyklonální protilátky, což je ve skutečnosti protilátka, která rozpoznává různé epitopy stejného antigenu. Další příklad se týká anti-RH1 protilátek . Imunitní osoba produkuje velké množství protilátek, tedy polyklonálních, které rozpoznávají různé epitopy proteinu RHD. Monoklonální protilátky používané v laboratoři rozpoznávají pouze jeden epitop této molekuly. Proto skutečnost, že určité varianty této molekuly mohou být rozpoznány činidlem - a proto v laboratoři označeny jako Rh Pozitivní - a nebudou rozpoznány druhým činidlem - a proto označeny jako Rh Negativní v jiné laboratoři.
Protilátky dnes patří „mezi nástroje nejčastěji používané v biologických vědách“ a zejména v biomedicínské oblasti , molekulární biologii , epigenetice , proteomice , ale také ve fluorescenční mikroskopii , pro sérologii nebo jako abzym .
V minulosti museli vědci vyrábět protilátky, které sami používali, a pak je společnosti komercializovaly (kolem roku 2010 přibližně 300 společností uvádí na trh více než 2 miliony protilátek, které byly prodány vědcům na trhu, který v roce 2011 dosáhl přibližně 1, 6 miliard dolarů, podle americkému konzultantovi Frostovi a Sullivanovi ). Četné studie však ukázaly, že mnoho prodávaných protilátek je nespolehlivých (např. V roce 2011 hodnocení 246 protilátek používaných v epigenetice ukázalo, že čtvrtina těchto protilátek selhala v testech specificity (což znamená, že se vážou na dva nebo více cílů). Čtyři z těchto 246 protilátek se navíc velmi specificky vázaly na protein, ale nebyly cílovým proteinem).
V říjnu 2015 průzkum provedený GBSI ukázal, že 52% výzkumníků nedokázalo ověřit identitu buněčných linií, které mohou být snadno kontaminovány nežádoucími odrůdami rychle rostoucích buněk. Jedná se o problém, který může vést k vážné zaujatosti vědeckého výkladu. Varování bylo rovněž věnováno anarchickému použití protilátek. Několik studií zpochybňuje reprodukovatelnost mnoha vědeckých experimentů. Mnoho autorů se domnívá, že protilátky jsou jedním z důležitých faktorů „krize reprodukovatelnosti“ (např. Závěry 47 z 53 historických studií výzkumu rakoviny založených na použití značení pomocí protilátek nemohly být reprodukovány. Jedno z největších hodnocení bylo provedeno pro Atlas lidských proteinů, švédské konsorcium zaměřené na produkci protilátek pro každý protein v lidském genomu. trh a dospěl k závěru, že méně než 50% by mohlo být účinně použito k mapování distribuce proteinů v konzervovaných vzorcích tkáně; často jsou za určitých podmínek efektivní, v jiných však katastrofická chyba). Podle výrobců, jako je NeuroMab, který produkuje protilátky pro neurovědy, přicházejí jeho protilátky s výslovným seznamem typů experimentů, které je mohou použít, „ale vědci ne vždy dodržují tyto pokyny . “ Společnost Abgent (společnost v San Diegu v Kalifornii prodávající protilátky), která je také dceřinou společností šanghajské společnosti WuXi AppTec, testovala všechny své protilátky zhruba před rokem. Vzhledem k výsledkům společnost stáhla přibližně 1/3 svých referencí ze svého katalogu, aby zlepšila kvalitu před svými zákazníky, což umožnilo snížit počet stížností.
Podle Leonarda Freedmana, prezidenta GBSI, je ještě závažnějším problémem to, že ještě větší počet vědců nevaliduje protilátky, které ve svých experimentech používají stále častěji a ve velkém měřítku, ale je to také nezbytné, aby Výzkum využívá protilátky, které jsou standardizované a mají přesný cíl, který je dokonale známý za podmínek, ve kterých bude experiment proveden, protože špatně fungující protilátky mohou poskytnout falešně pozitivní výsledky, pokud se vážou na jiné proteiny, než je jejich předpokládaný cíl. Mohou také produkovat „falešné negativy“, když se neváží na protein, na který mají cílit.
Tyto problémy opakovaně vedly vědce a časopisy k odvolání dříve publikovaných studií. V několika studiích také vedli vědce k tomu, aby vyvodili falešné nebo pochybné závěry. To také částečně vysvětluje nedostatek reprodukovatelnosti pozorovaný u určitých studií.
V roce 2016 nový průzkum GBSI zjistil, že téměř ve třetině případů si mladí vědci neudělají čas na ověření protilátek, které nakupují od komerčních dodavatelů, i když vědí, že jejich význam a přesnost jejich výsledků závisí na správném fungování a vhodnost těchto reagencií pro jejich práci. Dva důvody jsou nedostatek času a nadměrné spoléhání se na produkty na trhu. Tento průzkum však také odhaluje, že více než 50% odpovědělo, že nedostalo zvláštní školení o tom, jak hodnotit protilátky.
„To je velmi znepokojivé,“ komentuje Matthias Uhlen (z Královského technologického institutu ve Stockholmu , který vede mezinárodní pracovní skupinu pro ověřování protilátek, ale nebyl přímo zapojen do vyšetřování zveřejněného v roce 2016), zejména proto, že důležité ověřit pomocí testů přiměřenost komerční protilátky vůči funkci, kterou jí chceme přisoudit, protože například určité protilátky skutečně detekují protein v jeho „denaturované“ (v buňkách přípravku), ale ne v jeho přirozené složené formě - nebo naopak. Kromě toho může protilátka, která funguje dobře pro jeden typ tkáně nebo v určitém přípravku, produkovat falešné signály v jiných podmínkách.
Ověření protilátky je však složitější než správné ověření buněčné linie a také proto, že studie ukazuje, že mladí vědci (5 let zkušeností nebo méně) to dělají ještě méně než jejich starší: je jich pouze 43% k ověření protilátek, které nakupovat v obchodech ( „nejčastěji uváděný čas byl věnován času“ ), zatímco 76% výzkumných pracovníků s více než 10 lety zkušeností uvádí, že tak činí.
18% výzkumníků lékařské biologie dotazovaných v průzkumu GBSI připustilo, že neprovedli žádný z požadovaných ověřovacích postupů, a 15% respondentů si tím nebylo jistých.
Podle Freedmana lze problémy s reprodukovatelností přisuzované protilátkám vysledovat jak v tréninkovém deficitu, tak v použití nevhodných protilátek, což jsou dvě příčiny podporované nedostatkem jasných pokynů pro správnou praxi. Společnosti, které prodávají protilátky, navíc neposkytují dostatek informací o svém působení jako činidla a autoři článků ne vždy uvádějí katalogová čísla nebo čísla klonů použitých protilátek.).
Bylo učiněno několik pokusů o zlepšení způsobu, jakým vědci validují protilátky, a způsobu, jakým protilátky vykazují. Vědci, kteří ve své práci používají protilátky, je musí správně zaregistrovat, aby umožnili reprodukovatelnost jejich výzkumu (a tedy testování a kvalifikaci jinými vědci). Méně než polovinu výzkumných protilátek zmíněných v akademických pracích lze snadno identifikovat. Články v F1000 (v) 2014 a 2015 poskytují vědcům vodítko, jak hlásit použití výzkumných protilátek.
Od roku 2015 se uspořádalo několik skupin vědců, kteří se pokusili usnadnit oběh a ověřování informací o komerčních protilátkách vytvořením následujících nástrojů:
Tyto nástroje však nejsou vědecké komunitě velmi dobře známy.
Několik vědeckých časopisů (včetně časopisu Nature ) také začalo žádat své autory, aby specifikovali, zda protilátky použité v jejich vědeckých článcích byly pro jejich aplikaci profilovány.
V roce 2015 skupina vědců požadovala radikální přezkum výroby a prodeje protilátek a šíření souvisejících informací. V časopise Nature v roce 2015 proto Andrew Bradbury ( Los Alamos National Laboratory ) s více než 100 spoluzakladateli požádal, aby pouze protilátky byly definovány až do úrovně sekvence DNA, která je produkuje, a poté byly vyrobeny geneticky modifikovanými “ rekombinantní ”buňky, aby se získaly přísně standardizované produkty a zabránilo se variabilitě vyvolané produkcí stejné protilátky u hospodářských zvířat. Tento návrh by protilátky 10 až 100krát dražší, ale vyhnul by se ztrátám milionů dolarů v důsledku neúspěšných studií nebo zkreslených výsledků. Společnost A Bradbury však také požaduje konkrétní informace o jednotlivých protilátkách a tyto informace jsou mnoha společnostmi považovány za obchodní tajemství . Kromě toho jsou potřebné úplné informace o možných spolehlivých funkcích každé z těchto „rekombinantních protilátek“.
Další možností by bylo nechat si je syntetizovat viry.
v září 2016, tyto otázky budou znovu vzneseny (a možná vyřešeny) na 3denním setkání, které spojí poskytovatele a uživatele protilátek, stejně jako sponzory a vědecké časopisy v Asilomar (Kalifornie) vzáří 2016 , místo proslavené produkcí pokynů pro rekombinantní DNA .