Imunofluorescenční je technika imunobarvení , který používá protilátky , stejně jako fluorochromy . Imunofluorescence umožňuje odhalit specifický protein přímo v buňce pomocí emise fluorescence . Umožňuje tedy určit nejen přítomnost nebo nepřítomnost proteinu, ale také jeho umístění v analyzované buňce nebo tkáni.
Fluorescenční jev byl objeven v polovině XIX -tého století anglický vědec Sir George Gabriel Stokes . Byl prvním, kdo pozoroval, že fluorit , minerál , fluoreskuje, když je vystaven ultrafialovému záření , a dal mu jméno „fluorescence“.
První práce využívající imunofluorescence se datuje do padesátých let, kdy byly protilátky konjugovány s fluorochromy chemické povahy, jako je fluorescein .
První fluorescenční proteiny (podobné fluorochromům používaným v imunofluorescenci) byly objeveny mnohem později, s GFP ( Green Fluorescent Protein ), v šedesátých letech 20. století, autory Osamu Shimomura a Roger Y. Tsien . Díky odvození od medúzy ( Aequorea victoria ) jim objev tohoto proteinu přinesl Nobelovu cenu za chemii v roce 2008. V dnešní době je mnoho fluorochromů používaných v imunofluorescenci deriváty GFP.
Existují dva typy fluorescence. Za prvé, takzvaná „přirozená“ fluorescence nebo auto-fluorescence, spontánně emitovaná buňkou. Lze zmínit například chlorofyl rostlinných buněk. Pak je tu fluorescence udělená fluorochromem, chemickou látkou, která emituje světlo, pokud je excitována při určité vlnové délce.
V imunofluorescenci lze provést dva typy značení. První je přímá imunofluorescence. Během tohoto značení se používá protilátka namířená proti požadované molekule, nazývaná antigen. Tato protilátka je navázána na fluorochrom. K odhalení přípravku lze použít epifluorescenční mikroskop nebo konfokální mikroskop. Tato technika zůstává jednou z nejpoužívanějších ve vědeckém výzkumu.
Nepřímá imunofluorescence (IFI) je založena na postupném použití 2 protilátek: první protilátka monoklonálního typu specificky rozpoznává požadovaný protein. Druhá protilátka polyklonálního typu je namířena proti primární protilátce (první).
Toto je druhé označení. V tomto případě máme dvě protilátky. Primární protilátka je namířena proti požadovanému antigenu. Potom se použije druhá protilátka, značená fluorochromem, která má vysokou afinitu k primární protilátce (namířená proti izotypu primární protilátky, je to pak antiglobulin .)
Výhodou je možnost provádění vícenásobného značení na stejném vzorku buněk, rychlost a snadné použití této metody a také její dobrá spolehlivost. Kromě toho v nepřímé imunofluorescenci dochází ke zvýšení intenzity světla, protože na primárních protilátkách je několik vazebných míst, což umožňuje mít k nim připojeno několik sekundárních protilátek.
Existuje však několik nevýhod. Například možnost falešně pozitivních nebo falešně negativních reakcí, subjektivní zhodnocení stupně fluorescence a fenomén fotobělení. K překonání těchto nevýhod existuje několik technik. Nejprve proveďte negativní kontrolu nepřímé imunofluorescence, to znamená, že do kontaktu se vzorkem, který má být analyzován, vložte pouze sekundární (značené) protilátky. Po kroku promytí, pokud je negativní kontrola dobrá, by neměla emitovat fluorescenci, protože se sekundární protilátky nemohly vázat, a proto po kroku promytí odešli. Poté použití fotoaparátu s vysokým rozlišením a vysokou citlivostí tlumí fotobělení a umožňuje kvantitativní studium akvizice.
I když je princip imunofluorescence jednoduchý, v praxi je třeba vzít v úvahu mnoho faktorů.
Můžeme rozlišit tři oblasti:
Imunofluorescence se používá na buňkách v kultuře (budeme hovořit o imunocytochemii ) nebo na částech tkání ( imunohistochemie ).