Restrikční enzym je protein schopný řezání DNA fragmentu na charakteristické nukleotidové sekvence nazývané restrikční místo . Každý restrikční enzym tak rozpoznává specifické místo. V současné době je známo několik stovek restrikčních enzymů.
Přirozeně přítomné ve velkém počtu druhů bakterií se tyto enzymy staly důležitými nástroji v genetickém inženýrství .
Restrikční enzymy produkované bakteriemi tvoří obranný mechanismus proti infekcím bakteriofágy , viry specifickými pro bakterie. Když virus vstřikuje svou DNA do bakterií, je štěpen restrikčním enzymem na svých specifických místech. Zničení genomu viru tak blokuje infekci. Název restrikční enzym pochází z tohoto mechanismu: přítomnost těchto enzymů v bakteriích omezuje infekčnost bakteriofágů.
Aby se zabránilo restrikčnímu enzymu v řezání DNA vlastního genomu, bakterie také vytvářejí druhý enzym zvaný methyláza , který také rozpoznává restrikční místo. Methyláza neštěpí DNA, ale modifikuje ji přidáním methylové skupiny k jednomu nebo více nukleotidům místa. Tato methylace brání štěpení restrikčním enzymem.
Tento obranný mechanismus, nazývaný systém omezení / modifikace, systematicky kombinuje tyto dva enzymy, jeden pro řezání a druhý pro ochranu.
Restrikční enzymy patří do třídy endonukleáz , tj. Enzymy schopné štěpit fosfodiesterové vazby mezi dvěma nukleotidy v řetězci nukleové kyseliny, konkrétněji patří do třídy endodeoxyribonukleáz, protože jsou specifické pro DNA. Endonukleázy se liší od exonukleáz v tom, že mohou vnitřně štěpit vlákna nukleové kyseliny, zatímco exonukleázy napadají molekulu nukleové kyseliny pouze na jejích koncích.
Restrikční enzymy jsou schopny rozpoznat specificky a pouze krátkou sekvenci DNA o velikosti 4 až 10 párů bází a štěpit oba řetězce DNA duplexu na rozpoznaném místě. Tato vlastnost se již dlouho používá v molekulární biologii , protože umožňuje fragmentaci DNA na segmenty zmenšené velikosti řezáním na definovaných místech.
Restrikční enzymy lze použít k vytvoření genetické mapy (nazývané „restrikční mapa“) molekuly DNA. Restrikční mapa udává pořadí restrikčních míst podél této molekuly a velikost produkovaných fragmentů. Tato technika charakterizace nukleových kyselin, široce používaná před dvaceti lety, byla nahrazena přímým sekvenováním, které se stalo mnohem levnějším a rutinně prováděným.
Mohou být také použity k tomu, aby hostitelské buňky (např. Bakterie Escherichia coli ) produkovaly exogenní protein . Restrikční enzymy hrají v tomto procesu zásadní roli, protože umožňují rozštěpením řetězce na určitém místě a asymetricky integraci specifického řetězce DNA kódujícího specifický protein v plazmidu za účelem jeho exprese v bakterii . Tuto integraci lze provést s využitím asymetrie vytvořené restrikčním enzymem hraním sekvenční homologie v místě štěpení == místo integrace.
Podle prostorového vztahu mezi rozpoznanou sekvencí a místem štěpení je možné rozlišit tři typy restrikčních enzymů.
Enzymy typu I a typu III rozpoznávají specifickou sekvenci DNA a štěpí se na náhodném místě, asi 1000 párů bazí (bp) od sebe pro typ I a 25 bp pro typ III dále než restrikční místo. Tyto 2 typy mají kromě aktivity endonukleázy také aktivitu methylázy, která je odlišuje od typu II.
Nejběžněji používané enzymy typu II rozpoznávají specifickou sekvenci a štěpí na konkrétním místě v této sekvenci. Některé příklady těchto enzymů jsou uvedeny níže.
Obecně jsou restrikční enzymy blokovány ethidium monoazidem.
Názvosloví restrikčních enzymů je přesné. Jejich název má 3 nebo 4 písmena odpovídající mimo jiné bakteriím, ze kterých byl tento enzym extrahován:
Máme tedy E co R I: restrikční enzym kmene E scherichia (rod) co li (druh) R Y317 jako první charakterizovaný ( I )
Enzym | Zdroj | Uznaná sekvence | Střih | Konce (po řezu) |
Eco RI | Escherichia coli |
5 ' GAATTC 3' CTTAAG |
5 '--- G AATTC --- 3' 3 '--- CTTAA G --- 5' |
Soudržný |
BamHI | Bacillus amyloliquefaciens | 5'GGATCC 3'CCTAGG |
5 '--- G GATCC --- 3' 3 '--- CCTAG G --- 5' |
Soudržný |
HindIII | Haemophilus influenzae | 5'AAGCTT 3'TTCGAA |
5 '--- A AGCTT --- 3' 3 '--- TTCGA A --- 5' |
Soudržný |
MstII | Druhy Microcoleus | 5'CCTMAGG 3'GGAMTCC |
5 '--- CC TNAGG --- 3' 3 '--- GGAMT CC --- 5' |
Soudržný |
TaqI | Thermus aquaticus | 5'TCGA 3'AGCT |
5 '--- T CGA --- 3' 3 '--- AGC T --- 5' |
Soudržný |
Já ne | Nocardia otitidis | 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG |
5 '- GC GGCCGC - 3'
3 '- CGCCGG CG - 5' |
Soudržný |
HinfI | Haemophilus influenzae | 5'GANTC 3'CTNAG |
||
AluI | Arthrobacter luteus | 5'AGCT 3'TCGA |
5 '--- AG CT --- 3' 3 '--- TC GA --- 5' |
Upřímný |
BgIIII | Bacillus globigii | 5'AGATCT 3'TCTAGA |
5 '--- A GATCT --- 3' 3 '--- TCTAG A --- 5' |
Soudržný |
HaeIII | Haemophilus aegyptius | 5'GGCC 3'CCGG |
5 '--- GG CC --- 3' 3 '--- CC GG --- 5' |
Upřímný |
HhaI | Haemophilus haemolyticus | 5'GCGC 3'CGCG |
5 '--- GCG C --- 3' 3 '--- C GCG --- 5' |
Soudržný |
PstI | Providencia stuartii | 5'CTGCAG 3'GACGTC |
5 '--- CTGCA G --- 3' 3 '--- G ACGTC --- 5' |
Soudržný |
SmaI | Serratia marcescens | 5'CCCGGG 3'GGGCCC |
5 '--- CCC GGG --- 3' 3 '--- GGG CCC --- 5' |
Upřímný |
N a M v sekvenci MstII lze nahradit jednou ze 4 bází a jejím doplňkem. Restrikční sekvence MstII je příkladem nedokonalého palindromu, protože má lichý počet párů bází.
Enzymatické štěpení se obvykle provádí v mikrozkumavce umístěné ve vodní lázni při vhodně regulované teplotě (obvykle 37 ° C) na plovoucím stojanu.