Mikroskopie s vysokým rozlišením
Mikroskopie super-rozlišení je soubor technik pro zobrazování optickým mikroskopem objektů k vyřešení měřítku nanometrů . Vyznačuje se skutečností, že získané rozlišení již není omezeno fenoménem difrakce.
Popis
Kvůli difrakci světla je rozlišení běžného optického mikroskopu v zásadě omezeno, bez ohledu na použitý senzor a aberace nebo nedokonalosti čoček. Tato teorie byla založena v roce 1873 Ernstem Abbem a odráží skutečnost, že obraz bodu nikdy není bodem, ale vzdušným úkolem, jehož velikost je pravidelně definována vzorcem : kde λ je vlnová délka detekovaného světla, a ON numerická clona optického systému, tj. jeho schopnost sbírat úhly od objektů.
Z toho vyplývá, že při osvětlení ve viditelném prostoru, jehož vlnová délka je mezi 400 a 800 nm, as nejlepšími dostupnými digitálními aperturami (1,4 - 1,7), je rozlišení běžného optického mikroskopu fyzicky omezeno řádově na 200 nm.
Mikroskopy super-rozlišení (nebo nanoscopes ) jsou schopné zachytit obraz s rozlišením lepším než difrakčním limitem. Můžeme rozlišit tři hlavní techniky superrozlišování: SIM, STED a lokalizační mikroskopie.
Můžeme také hovořit o super-rozlišení, když používáme řízené jevy, jako je evanescentní osvětlení v TIRF nebo techniky blízkého pole. Digitální zpracování, jako je dekonvoluce nebo extrakce informací z fluorescence (SOFI, SRRF atd.), Také umožňuje dosáhnout super-rozlišení, ale nespoléhá se na fyzickou modifikaci systému.
Mikroskopie SIM
Pokles rozlišení je částečně způsoben zadní ohniskovou rovinou objektivu, který má konečnou velikost a působí jako dolní propust na zachycených úhlech. Je to on, kdo mimo jiné definuje digitální otevření systému. Tím se sníží vysoké frekvence přicházející z objektu, které obsahují podrobnosti a přispívají k lepšímu rozlišení.
Na druhou stranu, osvětlením vzorku specifickým osvětlením je možné kombinovat část vysokých frekvencí s nižšími frekvencemi osvětlení pomocí fenoménu Moiré. Část dříve zkrácených frekvencí se poté převede do zadní ohniskové roviny a stane se detekovatelnou. V praxi se SIM vyrábí pod různými osvětlením, zejména překlady a rotacemi: obecně je k rekonstrukci 2D obrazu potřeba 9 obrazů a pro 3D obraz 15. Výsledný digitální obraz lze poté vyřešit dvakrát. To je princip SIM.
Mikroskopie STED
Mikroskopie STED je skenovací mikroskopie typu point-to-point, obdobná jako u konfokálního mikroskopu, kde je excitační paprsek světla zaměřen na vzorek. Jeho princip je založen na snížení úlohy efektivního osvětlení systému. Buzení, stejně jako obraz, je vystaveno fenoménu difrakce, a proto jej nelze jemně omezit pod 200 nm, na druhou stranu superpozicí dutého deplečního paprsku na excitační paprsek je možné omezit fluorescenci na střední část , což je pak méně než difrakční limit.
STED je ze své podstaty poměrně pomalý a spíše omezený na pozorování stacionárních vzorků. Obvykle dosahuje rozlišení mezi 70 a 120 nm .
Lokalizační mikroskopie
Poznámky a odkazy
- (fr) Tento článek je částečně nebo zcela převzat z článku anglické Wikipedie s názvem „ Mikroskopie s vysokým rozlišením “ ( viz seznam autorů ) .