Chromatografie (starořečtina χρῶμα / Khroma , „barva“ a γράφειν / graphein , „zápis“) je chemická metoda pro separaci různých látek obsažených v směsi ( vzorek fáze homogenní kapalina nebo plyn ).
Zařízení používané k provádění určitých chromatografií se nazývá chromatograf . Obraz nebo diagram získaný chromatografií se nazývá chromatogram . Při použití chromatografu a chromatografie software , chromatogram se zpravidla provádí ve formě grafu , který znázorňuje změnu parametru týkajícího se koncentrace v rozpuštěné látky na výstupu z kolony, jako funkce času (nebo objem) jako elučního činidla .
Vzorek obsahující jeden nebo více druhů je strháván proudem mobilní fáze (kapalina, plyn nebo nadkritická tekutina ) ve styku se stacionární fází (papír, želatina , oxid křemičitý , polymer, roubovaný oxid křemičitý atd.). Každý přítomný druh migruje rychlostí, která závisí na jeho vlastnostech a vlastnostech dvou přítomných fází.
Chromatografie může být analytická (zaměřená na identifikaci přítomných látek) nebo přípravná (zaměřená na oddělení složek směsi). Analytická chromatografie je široce používána v laboratorním měřítku v organické chemii . Je vhodný pro miniaturizaci a dal vzniknout několika technikám chemické analýzy, které spočívají ve sdružování oddělených sledovaných sloučenin ( analytů ) ve stejném přístroji s následnou identifikací (a / nebo jejich kvantifikací). , obvykle spektroskopickou metodou . Preparativní chromatografie se zřídka používá ve velkých množstvích kvůli její ceně a pomalosti.
Ruský botanik Michail Tswett (Tsvett) jako první použil termín „chromatografie“ v roce 1906 . Následně se Tswettova technika nazývá adsorpční chromatografie, aby se odlišila od ostatních, které ji následovaly.
Tswett používal adsorpční kolony od roku 1903 k oddělení pigmentů od rostlin. Spekulovali jsme proto o etymologii slova „chromatografie“ ze starořečtiny χρῶμα / khrôma , „barva“ a tedy pigment. Tswett nikdy nevysvětlil toto, ale tswett je ruské slovo pro „barvu“.
V roce 1952 , Martin a Synge získal Nobelova cena za chemii pro jejich vynález z dělicí chromatografie .
Chromatografie je založena na strhávání vzorku rozpuštěného mobilní fází (nebo eluentem) stacionární fází (nebo fixní fází). Stacionární fáze, fixovaná buď na vnitřním povrchu kolony, nebo na rovném povrchu, více či méně silně zadržuje látky obsažené ve zředěném vzorku podle intenzity nízkoenergetických interakčních sil (jako jsou síly Van der Waals , vodíkové vazby atd.) Vytvořené mezi různými molekulárními druhy a stacionární fází. V závislosti na použité chromatografické technice je separace složek strhávaných mobilní fází výsledkem buď jejich postupné adsorpce a desorpce na stacionární fázi, nebo z jejich odlišné rozpustnosti v každé fázi.
Různé složky vzorku mají obvykle charakteristickou rychlost, která umožňuje jejich oddělení nebo dokonce jejich identifikaci. Tato separační rychlost silně závisí na povaze mobilní fáze a stacionární fáze. Řízení všech podmínek separace umožňuje dokonalou reprodukovatelnost doby migrace dané sloučeniny.
Vzorek se často analyzuje porovnáním s látkami, které jsou ve vzorku již známy, nebo porovnáním s výsledky analýzy standardního roztoku (komerční roztok obsahující známé látky ve známých koncentracích). Tyto látky slouží jako reference a umožňují identifikovat nebo měřit každý druh porovnáním rychlostí separace (a případně dalších informací daných detekcí). Toto je analytická chromatografie .
V ostatních případech jsme spokojeni s oddělením frakcí k jejich identifikaci jinými technikami: jedná se o preparativní chromatografii .
Aby se zlepšila kvalita oddělení a identifikace, nová zařízení umožňují:
Rozlišovací schopnost sloupce je funkcí relativní sazeb elučních. Tyto rychlosti jsou proto funkcí distribučního koeficientu rozpuštěných látek mezi 2 fázemi:
Rozdělovací koeficient :
kde C S je koncentrace rozpuštěné látky ve stacionární fázi a C M je koncentrace rozpuštěné látky v mobilní fázi.
Retenční čas t R : Doba, která uplyne mezi nástřiku vzorku a výskytem rozpuštěného vrchol na detektoru na chromatografickou kolonu.
Mrtvý čas t M : čas potřebný k tomu, aby druh, který nebyl zadržen stacionární fází, překročil kolonu.
Průměrná lineární rychlost rozpuštěné látky :
kde L je délka sloupce.
Průměrná lineární rychlost mobilní fáze :
Vztah mezi rychlostí posunutí a distribučním koeficientem:
kde V S a V M jsou objemy rozpuštěných látek ve stacionární a mobilní fázi (nazývané také mrtvý objem ), ale tyto objemy jsou úměrné objemům 2 fází, lze je tedy odhadnout, pokud známe geometrickou strukturu sloupce.
Zkrácený čas t ' R :
Snížený objem V ' R :
Průtok D :
Lze změnit některé parametry, které ovlivňují relativní rychlost analytů:
Kapacitní faktor k ' : důležitý experimentální parametr umožňující popsat rychlost postupu rozpuštěných látek ve sloupcích. Jde o poměr množství analytů přítomných v rovnováze ve 2 objemech sousední stacionární a mobilní fáze. Kapacitní faktor závisí na teplotě (CPG), náplni kolony (CPG), složení mobilní a stacionární fáze (HPLC) ...
Faktor selektivity α : poměr distribučního koeficientu rozpuštěné látky, který je zachován nejvíce, oproti distribučnímu koeficientu rozpuštěné látky, který je zachován nejméně. Faktor selektivity dvou analytů se používá k odhadu, jak dobře je může sloupec oddělit. Používá se proto k výpočtu rozlišovací schopnosti sloupce. α> 1 vždy.
Účinnost sloupce závisí na stupni rozšíření píku, která se vyskytuje jako analyt pohybuje přes kolonu. Toto rozšíření závisí na době zdržení analytu ve 2 fázích:
Účinnosti kolony se hodnotí z jedné nebo druhé z těchto dvou podmínek:
Účinnost se zvyšuje, když N roste nebo když H klesá na konstantní L. Berouce na vědomí rozptyl, šířku píku ve střední výšce a šířku ve spodní části píku,
Důležitost kinetických účinků na účinnost kolony závisí v zásadě na době trvání kontaktu mezi mobilní fází a stacionární fází, která sama závisí na rychlosti toku mobilní fáze. Šíření vrcholu je minimalizováno zmenšením velikosti částic výplňového materiálu a průměru kolony. Ve skutečnosti je stacionární fáze granulována a rozpouštědlo zaujímá objem mezer, tento objem se nazývá mrtvý objem rozpouštědla. H se zvyšuje s tímto objemem a klesá s průměrem kolony.
Rozlišení R S kolony je kvantitativní míra jeho schopnosti oddělit dva analyty A a B:
Poznámka : rozlišení 1,5 odpovídá maximálnímu pokrytí 1%.
Souvislost mezi rozlišením a počtem teoretických desek:
Tento vztah umožňuje oznámení, že rozlišení R S kolony je přímo úměrná druhé odmocnině jeho délky, protože počet teoretických pater N je úměrný délce L kolony. S danou stacionární fází lze zlepšit rozlišení kolony zvýšením počtu teoretických desek a tím zvětšením délky kolony. To ale prodlužuje dobu trvání analýzy, takže je nutný kompromis.