Tyto barviva Hoechst jsou součástí rodiny barviv s markery, fluorescenční použité pro označení na DNA . Tyto sloučeniny z rodiny bisbenzimidů byly původně vyvinuty společností Hoechst AG, která počítala s jejími výtvory. Tak, Hoechst 33342 je sloučenina N O 33342 od této společnosti. Existují tři podobné sloučeniny barvící DNA: Hoechst 33258 , Hoechst 33342 a Hoechst 34580 . Hoechst 33258 a Hoechst 33342 barviva jsou nejčastější a mají podobnou excitační / emisní spektra . Hoechst 33342 má propustnost buněk desetkrát větší, než je H33258.
Obě sloučeniny jsou excitovány paprsky ultrafialového záření na vlnovou délku kolem 350 nm , obě emitují azurově modré světlo fluorescencí . Maximální vlnová délka emise je 461 nm . Když je barvivo nevázané, fluoreskuje maximem mezi 510 a 540 nm . Hoechstovo zbarvení může být vzrušeno xenonovou výbojkou nebo rtuťovou výbojkou nebo UV laserem . Posun Stokes mezi excitací a emisí maxima činí Hoechst barvení velmi užitečné v experimentech, kde velký počet fluoroforů se používají. Intenzita fluorescence skvrn zvyšuje Hoechst s pH v rozpouštědle .
Hoechstova barviva jsou rozpustná ve vodě a v organických rozpouštědlech, jako je dimethylformamid nebo dimethylsulfoxid . Roztoky lze získat až do koncentrace 10 mg / mℓ . Tyto vodné roztoky jsou stabilní, více než šest měsíců, pokud je uložen mezi 2 a 6 ° C a chráněn před světlem. Pro delší konverzace, roztoky se zmrazí při teplotě pod -20 ° C .
Barvivo se váže na vedlejší drážku dvouvláknové DNA s větší afinitou k sekvencím bohatým na adenin a thymin . Vazba na tyto sekvence bohaté na AT značně zvyšuje získanou fluorescenci. Hoechstovo barvení je pro buňky propustné: umožňuje označit pevné živé buňky.
Pro barvení eukaryotických nebo prokaryotických buněk se obvykle používá koncentrace mezi 0,1 a 12 μg / mℓ . Značení trvá od jedné do třiceti minut při pokojové teplotě nebo 37 ° C , poté se buňky opláchnou. Zelenou fluorescenci, odpovídající nenavázanému barvivu, lze pozorovat, pokud bylo použito příliš mnoho sloučeniny nebo pokud nebyl vzorek řádně vypláchnut. Hoechstovo barvení se často používá jako alternativa k jinému barvivu nukleové kyseliny : DAPI .
Hlavní rozdíly mezi barvivy Hoechst a DAPI:
Barviva Hoechst 33342 a 33258 jsou vypnuta („ zhášena “ frenglish Laboratory, [kwenche] foneticky ) bromodeoxyuridinem (BrdU), který se používá k detekci dělících se buněk. Posledně jmenované integrují BrdU do nově syntetizované DNA místo thymidinu . Když je BrdU inkorporován do DNA, předpokládá se, že bromidová část narušuje vedlejší drážku dvojité šroubovice a brání tomu, aby barvivo Hoechst dosáhlo svého optimálního vazebného místa. Hoechstovo barvivo lze použít spolu s BrdU ke sledování progrese buněčného cyklu .
Hoechstova barviva se často používají k barvení genomové DNA v následujících případech:
Díky své vazbě na DNA tato barviva interferují s replikací DNA během dělení buněk . V důsledku toho jsou potenciálně mutagenní a karcinogenní , takže při manipulaci a nakládání s nimi jako s odpadem je třeba dodržovat určitý počet pravidel. Hoechstova skvrna se používá k třídění spermatu v případě lidských populací. Jeho bezpečnost byla diskutována.