Hammerhead ribozym ( hammerhead ribozym v angličtině) je segment RNA, která katalyzuje na štěpení a vratné spojení určitého místa na molekulu RNA. Tyto ribozymy se používají jako modely pro výzkum struktur a vlastností RNA a také pro cílené experimenty štěpení RNA, některé pro terapeutické aplikace. Dostávají své jméno podle podoby nejranějších reprezentací jejich sekundární struktury se žralokem kladivounem . Nejprve byly identifikovány mezi satelitními RNA a viroidy a poté bylo zjištěno, že jsou velmi široce distribuovány v mnoha formách života.
Samoštěpicí reakce, poprvé publikované v roce 1986, jsou součástí mechanismu kruhové replikace . Sekvence těchto ribozymů je dostatečná pro vlastní štěpení a funguje vytvořením konzervované trojrozměrné terciární struktury .
První ribozymy kladivounů byly objeveny v roce 1986 u některých infekčních agens rostlin RNA, jako jsou viroidy a satelity . Následující rok byl identifikován další v satelitní DNA z mločích genomů . Další příklady těchto ribozymů byly nalezeny v genomu různých organismů, jako jsou schistosomy , jeskynní cvrčci , kraby dámy a někteří savci, jako jsou hlodavci a ptakopysk . V roce 2010 vyšlo najevo, že ribozym kladivounů je ve skutečnosti rozšířen v genomu bakterií až po eukaryoty , včetně lidí . Podobné publikace následně tato pozorování potvrdily a rozšířily a odhalily všudypřítomnou povahu ribozymu kladivounů ve všech živých královstvích.
V eukaryotických genomech se zdá, že mnoho ribozymů kladivounů souvisí s retrotranspozony ( SINE ), s výjimkou jedné překvapivě konzervované rodiny nalezené v genomu všech amniotů ; druhé, tzv HH9 a HH10, se nacházejí v intronů několika málo specifických genů a odkazují na biologickou funkci, která je zachována během biosyntézy v pre-messenger RNA .
Sekvence Minimální potřebný pro reakci se samoštěpici zahrnuje asi 13 nukleotidů, které tvoří „jádro“ nebo „srdce“, konzervovaná, většina z těchto nukleobází nejsou zapojeny do párů bazí kanonických Watson-Crick typu. Tato oblast je ohraničena třemi oblastmi kmenové smyčky sestávajícími v podstatě z kanonických párů bází typu Watson-Crick, ale bez jakéhokoli dalšího omezení z hlediska sekvence. Minimální hammerhead ribozym katalytická konstanta je asi 1 min -1 - rozsah hodnot 0,1 min -1 až 10 min -1 je běžně pozorována v závislosti na nekonzervativních sekvence a délky tří spirálovitých drátů - v standardní reakční podmínky: koncentrace v Mg 2+ od asi 10 mmol l -1 , pH 7,5 a teperature na 25 ° C . Většina výzkumu ribozymů kladivounů byla provedena na minimálním ribozymu.
Ribozym hammerhead je strukturován do tří šroubovic složených ze spárovaných bází, které jsou spojeny dohromady krátkými segmenty se zachovanými sekvencemi. Tyto vrtule se nazývají I , II a III . Hammerhead ribozymy mohou být rozděleny do tří typů založených na počtu šroubovice, ve kterém 5 ‚a 3‘ konce jsou umístěny: Typ I se vyskytuje v genomu z prokaryot , eukaryot a agentů infekční. Na RNA z rostlin , zatímco typ II byl popsán pouze u prokaryot a typ III se vyskytuje primárně u rostlin, infekčních agens z rostlin a prokaryot.
Kompletní ribozym hammerhead obsahuje další sekvence v prutech I a II, které umožňují vytvoření dalších intramolekulárních kontaktů stabilizujících aktivní terciární strukturu molekuly a umožňujících dosáhnout rychlosti štěpení tisíckrát vyšší, než jsou sekvence minimálně.
Minimální ribozym kladivohlavý byl rozsáhle studován biochemiky i rentgenovou krystalografií , NMR spektroskopií a dalšími vyšetřovacími biofyzikálními technikami . První podrobná trojrozměrná struktura minimálního ribozymu byla získána v roce 1994 rentgenovou difrakcí ribozymu hammerhead vázaného na analog DNA DNA , struktura all-RNA bude publikována v příštím roce. Ta ukázala, tři spárované ribonukleotidových šroubovic , nazvaný I , II a III , jsou odděleny krátkými konzervovanými sekvencemi: konektor mezi helixy I a II obecně obsahuje sekvenci C U G A , zatímco jeden se nachází mezi šroubovicemi II a III obsahuje sekvenci G AAA ; aktivní místo v reakci o štěpení leží mezi helixy I a III , které se obvykle nacházejí na zbytek o cytosin .
Ukázalo se však, že tato krystalizovaná struktura získaná rentgenovou difrakcí je obtížně sladitelná s geometrickými omezeními odvozenými z analýz nukleární magnetickou rezonancí a z biochemických experimentů určených ke studiu kinetiky a katalytického mechanismu ribozymu. Invariantní zbytky C3 , G5 , G8 a G12 minimálního ribozymu jsou tedy kritické do té míry, že sebemenší substituce exocyklické funkční skupiny na jednom z těchto zbytků vede k téměř úplnému nebo dokonce úplnému vymizení veškeré katalytické aktivity a to, i když se nezdá, že tvoří vodíkovou vazbu jako součást páru Watson-Crick v jakékoli z minimálních krystalových struktur ribozymu kladivové hlavy - kromě zbytku G5 . Byly zdůrazněny další obtíže, například roli G8 a G12 zbytky v kyselé / zásadité katalýzy ribozymu, že krystalizované struktury netvoří zřejmé, nebo nukleární Overhauserův efekt pozorován nukleární magnetické rezonance mezi nimi. Zbytky U4 a U7 , což krystalická struktura nedokáže vysvětlit, protože tento účinek vyžaduje maximální vzdálenost 6 Á, což je stěží kompatibilní se strukturou získanou rentgenovou krystalografií.
Tyto obtíže - a některé další, které znesnadňují sladění struktur získaných krystalografií s geometrickými omezeními odvozenými jinými přístupy - ovlivňující terciární strukturu minimálních ribozymů kladivounů, byly do značné míry vyřešeny krystalizovanou strukturou úplných ribozymů. Ten ukazuje četné interakce mezi smyčkami prutů I a II , a to i ve vzdálenosti od aktivního místa .
Trojrozměrná konfigurace aktivního místa kladívkového ribozymu je stabilizována četnými intramolekulárními interakcemi úplného ribozymu , čímž se vyrovná 2 ' kyslík zbytku C17 , který tvoří nukleofil katalytického místa, téměř dokonale pro bimolekulární nukleofilní substituci (S N 2). Zbytek G12 je dostatečně blízko k tomuto nukleofilu, aby s ním vytvořil vodíkovou vazbu a umožnil odečtení protonu od 2 'kyslíku, pokud je zbytek G12 sám deprotonován. 2 ' hydroxylová skupina zbytku G8 vytváří vodíkovou vazbu s kyslíkem skupiny 5', a je tedy pravděpodobné, že poskytne proton, když se na 5 'kyslíku ribózy zbytku AI nahromadí záporné náboje .
Výměna G8 zbytek s C8 zbytkem ( G 8 C mutace ) eliminuje katalytickou aktivitu na hammerhead ribozymu, zatímco dvojité C 3 G + G 8 C mutace zachovává většinu z nich; nahrazení G8 zbytek s G8 deoxy zbytku velmi výrazně snižuje katalytickou aktivitu, což naznačuje, že se 2 ‚hydroxylové tohoto zbytku je skutečně důležité pro jeho reakčním mechanismem.
Aproximace zbytku A9 a fosfátů scissile (en) vyžaduje vysokou koncentraci v kladných nábojích, což vede k pozorování, že dvojmocný iontový kov, jako je Mg2 +, je vyžadován pro nízkou iontovou koncentraci, ale může být dispergován s vyšší koncentrací jednomocných kationtů . Reakce tedy pravděpodobně zahrnuje extrakci 2 'protonu ze zbytku C17 a poté nukleofilní útok sousedního fosfátu. Ribosy z G8 zbytku pak poskytuje proton na lámání vazby mezi štěpné fosforu a 5 ‚kyslíku odstupující skupiny a pak se reprotonují z molekuly vody .
Navrhovaný reakční mechanismus pro aktivní místo ribozymu kladivounů. Báze ( B ) odstraňuje proton z 2 'kyslíku, zatímco kyselina ( A ) poskytuje proton 5' odstupující skupině, což vede k 2 ', 3' cyklickému fosfátu. Zlomené (červeně) a vytvořené (tečkovaně) vazby musí být v axiální poloze přibližně 180 ° na obou stranách. Pohyb elektronů je znázorněn šipkami.
Možné interakce přechodového stavu extrapolované ze struktury krystalizovaného ribozymu.
Aktivní místo úplného ribozymu kladivounů. Zbytek G12 je umístěn v souladu s jeho rolí jako báze při štěpné reakci, zatímco 2 ' hydroxylová skupina zbytku G8 je umístěna v souladu s jeho rolí kyseliny pro katalýzu kyselina / báze . Tyto vodíkové vazby potenciálně „aktivní“ jsou zvýrazněny oranžové body. 2 'kyslík zbytku C17 se jeví zarovnaný pro nukleofilní útok podél cesty zobrazené modrou tečkovanou čarou.