Stabilizace plazmidů

Tyto plasmidy jsou prvky DNA, obvykle kruhové a dvouvláknové. Vyskytují se v mnoha bakteriích kromě základního bakteriálního genomu . Jejich přítomnost není a priori nezbytná pro přežití jejich hostitelské buňky, i když mohou nést geny kódující funkce poskytující evoluční výhody, jako je využití zdroje prostředí, syntéza prvku. Esenciální není k dispozici v médiu nebo rezistence jedu. Pokud tomu tak není, představují plazmidy mrtvou váhu v důsledku použití buněčných zdrojů. Ve skutečnosti jsou replikovány a jejich geny jsou exprimovány na částečnou újmu replikace a exprese vlastního genomu buňky. Při absenci selekčního faktoru pro přítomnost plazmidu by proto byla v populaci upřednostňována dceřiná buňka, která by nedostala kopii plazmidu během dělení své mateřské buňky .

Pokud jde o bakterie , je třeba poznamenat, že většina obsahuje jeden nebo více plazmidů v divokém stavu, i když chybí jakýkoli faktor prostředí příznivý pro jejich udržení. Tato údržba (nebo stabilizace) plazmidu v populaci proto využívá další principy.

Replikace plazmidu se provádí buněčným aparátem, ale počátek replikace a určité replikační faktory jsou specifické pro plazmid. Počet kopií plazmidu je tedy definován samotným plazmidem. Jednoduchý stabilizační systém tedy spočívá ve zvýšení počtu kopií tak, aby jejich náhodné rozdělení umožnilo po rozdělení je najít v každé dceřiné buňce. Pravděpodobnost, že se buňka ocitne bez kopie plazmidu, je 2 -n, kde n je počet kopií před dělením. Plazmid přítomný v 10 kopiích tedy riskuje ztrátu každých 1024 dílků. U 20 kopií tato pravděpodobnost klesne na méně než jednu šanci z milionu (pravděpodobnost se dále sníží o většinu plazmidů v buňce). Jakkoli to může být vzácné, tato ztráta přesto zůstává evoluční výhodou oproti buňkám, které stále musí nést zátěž dvaceti plazmidů.

Stabilizace plazmidu s nízkým počtem kopií v populaci, která jej hostí, vyžaduje další mechanismy. Tyto mechanismy jsou různých typů a pro větší účinnost jsou často kombinovány na stejném plazmidu. Zde je přehled.

Rozlišení multimerů

Různé kopie plazmidu mají stejnou sekvenci DNA . Mohou tedy být předmětem homologních rekombinací , a tak vytvářet multimery několika plazmidů. Protože regulace počtu kopií se provádí podle počtu počátků replikace a počtu nezávislých plazmidů, multimerizace snižuje počet celkových jednotek, které mají být distribuovány v dceřiných buňkách, a tím zvyšuje pravděpodobnost produkce dceřiné buňky. bez plazmidové kopie.

Řešení spočívá v tom, že plazmid kóduje rekombinázový systém (nebo používá takový systém přítomný na chromozomu), což umožňuje rozlišení multimerů na monomery. ParCBA Operon bakteriálního plazmidu RK2 je příkladem takového systému, který obsahuje geny pro resolvase para, se nukleázou ParB a protein neznámé funkce, Park.

Aktivní systémy oddílů

Systémy oddílů  se skládají ze sekvencí, jejichž funkce je podobná funkci eukaryotických centromer . Některé modely naznačují, že tyto sekvence jsou spojeny proteiny s jedinečnými prvky přítomnými v každé dceřiné buňce. Tyto prvky by mohly být například umístěny na chromozomu nebo na membráně.

Jiné modely navrhují párování plazmidů podle jejich centromerní sekvence. Ty by pak byly distribuovány do dceřiných buněk buď vlákny, nebo umístěním páru na vytvářející přepážku , plazmid na každé jeho straně.

Příklady aktivních systémů dělících jsou parA plasmidu R1 (nezaměňovat s para o parCBA operonu plasmidu RK2), SOP plazmidu F nebo podle plasmid- profág P1.

Jed-antidotní systémy

Tyto systémy se také nazývají moduly závislostí ( moduly závislostí ), systémy naprogramované smrtí nebo systémy postsegregační zabíjení (PSK nebo zabíjení „postsegregační“, ve francouzštině obvyklé). Byly identifikovány na mnoha plazmidech s nízkým počtem kopií v gramnegativních bakteriích .

Ve stejném operonu plazmidu jsou kódovány jed a protilátka proti tomuto jedu ( obr. 1.A ). Protilátka je ve srovnání s jedem relativně nestabilní, protože je rychle degradována aktivitou proteázy závislé na ATP . Musí se proto udržovat v dostatečné koncentraci, aby se potlačil účinek jedu, který vyžaduje přítomnost plazmidu. Ve skutečnosti, pokud během dělení dceřiná buňka neobdrží kopii plazmidu, protijed, který je stále v cytoplazmě, se degraduje, aniž by již nemohl být syntetizován de novo . Jed proto může působit tak, že buňku zabije, a proto se jmenuje postsegregační zabíjení ( obrázek 1.B ). Termín „modul závislosti“ znamená, že buňka je „závislá“ ( závislá ) na svém „dávkovém“ protijedu, aby přežila.

Protilátka může být buď antisense brání translaci na jed messenger RNA, jako je tomu v hok / sok systému , nebo protein inhibuje působení jedovatého proteinu tvorbou komplexu s ním. Protein-proteinové systémy, až na několik výjimek, mají některé společné vlastnosti:

Zde je několik příkladů proteinových systémů jed-protilátka uvedených v tabulce na konci článku:

- ccd

Tento systém, dosud nejlépe studovaný, je umístěn na F plazmidu Escherichia coli . Dva geny operonu ccd kódují dva proteiny: protilátku CcdA (72 aminokyselin) a jed ccdB (101 aminokyselin). Izolací rezistentního mutantního ccd se ukázalo, že cílem ccd je DNA gyráza , topoizomeráza typu II zahrnovala správu nadšroubovicové DNA. Následně bylo také prokázáno, že ccdB otravuje gyrázu a způsobuje, že způsobuje dvojvláknové zlomy v DNA způsobem závislým na ATP.

Otrava gyrázy ccdB způsobuje indukci systému SOS . Tento systém je aktivován během jakékoli události blokující postup vidlice replikace DNA . Tyto události mohou být stejně rozmanité jako zlom DNA, dimer thyminu nebo dokonce proteinový komplex s DNA. Indukce SOS blokuje proces dělení buněk, zatímco je poškození opraveno. Vzhledem k tomu, že buňka nadále roste, ale nerozděluje se, zdá se být vláknitá.

Samorepresi operonu CCD vyžaduje přítomnost CcdA ET ccdB . Tvar zapojený do vazby na DNA je tetramer (CcdA) 2 - ( ccdB ) 2 , volná forma jako hexamer (CcdA) 2 - ( ccdB ) 4 , což naznačuje, že relativní pokles množství CcdA snižuje represi a tím podporuje jeho syntézu. CcdA41, delece obsahující pouze C-koncových 41 aminokyselin CcdA, ztrácí schopnost samoregulace při zachování svých anti-zabíjejících vlastností. To silně naznačuje, že N-koncová část CcdA je zodpovědná za vazbu na promotor operonu ccd . Tuto hypotézu podporuje skutečnost, že bodová mutace z argininu 4 na alanin v CcdA ruší represivní aktivitu.

CcdA protein je degradován Lon proteázou navzdory své afinitě k Lon, která je mnohem nižší než afinita k ccdB . Modely nabízejí buď „náhodně“ degradační formy, které zdarma CcdA postačují k postsegregačnímu zabíjení , nebo že existuje aktivní proces destabilizující komplexní CcdA- ccd .

- pem

Pem operon plazmidu R100 ( E. coli ) kóduje protilátku PemI (84 aminokyselin) a jed PemK (110 aminokyselin). Tento systém je identický se systémem parD plazmidu R1, protijedu, který se pak nazývá Kis a jed Kid, ale použijeme křestní jméno, abychom se vyhnuli jakékoli záměně se systémem parDE, který je podrobně popsán níže.

Stejně jako ccd je stabilizace plazmidu způsobena degradací protijedu PemI Lonem a úplná autoreprese vyžaduje jak jed, tak protijed, i když slabá represe je pozorována u samotného antidota.

Terčem PemK jedu by mohl být DnaB. DnaB je helikáza podílející se na zahájení replikace DNA a nadprodukce DnaB inhibuje toxické působení PemK). PemK by působil jako inhibitor buněčného dělení, i když u některých kmenů byl pozorován postsegregační účinek usmrcování .

- parDE

RK2 (také nazývaný RP4) je velký plazmid o velikosti 60 kb (1 kb = jeden tisíc párů bází DNA). Jeho hostitel rozsah je velmi široký bakterie Gram negativních s takovými různých hostitelích, že E. coli ( Enterobacteriaceae ), Agrobacterium tumefaciens (bakteriální patogen rostlin) z Rhizobia ( symbiotické z impulsů ) nebo Pseudomonas aeruginosa ( patogenní lidský odpovídá zejména za nozokomiální infekce ). Nachází se tam ve 4 až 8 kopiích na chromozom v závislosti na druhu.

Za stabilizaci RK2 je zodpovědný lokus 3,2 kb s názvem par . Obsahuje pět genů uspořádaných do dvou odlišných operonů . První operon, parCBA (2,3 kb), již zmíněný výše, je zodpovědný za systém rozlišení multimerů a druhý, parDE (0,7 kb), je postsegregační systém usmrcování, kde ParD je protijed (83 aminokyselin) a ParE jed (103 aminokyselin). Kombinace těchto dvou systémů umožňuje velmi nízkou míru ztráty, ale relativní příspěvek těchto dvou operonů ke stabilizaci je proměnlivý podle kmene E. coli a teploty růstu.

Cíl jedu ParE ještě nebyl stanoven, ale jako ccd způsobuje ParE zabíjení buněk, které ztratily inhibici replikace plazmidu, indukci SOS systému a také vzhled vláknitých bakterií. Znalost na jedné straně rozmanitosti hostitelů, ve kterých je systém parDE RK2 funkční, a na druhé straně obtíže při hledání mutantů rezistentních na ParE si lze rozumně myslet, že ParE ovlivňuje základní a velmi konzervovanou funkci v evoluci, a pravděpodobně velmi aktivní místo svého cíle.

ParE je kódován genem začínajícím jednou bází před stop kodonem parD . Pokud nejsou známy koncentrace ParD a ParE in vivo , lze odhadnout, že exprese ParE je mnohem nižší než exprese ParD, přičemž parE je druhým genem operonu a navíc začíná kodonem TTG . velmi efektivní na rozdíl od jiných jedů, které začínají klasickým kodonem ATG.

Autoreprese je prováděna ParD nebo komplexem ParD-ParE, aniž by byla při této represi detekována jakákoli akce ParE. Pokud je ParD nalezen ve formě dimeru v roztoku, váží se na promotor 4 molekuly ParD .

3D struktura ParD není známa, ale předpovědi sekundární struktury se sbíhají a říkají, že obsahuje N-koncový β řetězec následovaný 3 nebo 4 α-šroubovicemi spojenými krátkými smyčkami. Tyto výsledky odpovídají studiím cirkulárního dichroismu a nukleární magnetické rezonanční spektroskopie. ParD by se tak připojil k rodině proteinů vázajících β-list DNA.

Stejným způsobem jako u CcdA a PemI je proteáza E. coli odpovědná za relativní nestabilitu ParD Lon).

- mazEF a další chromozomové systémy

Modul mazEF (nebo chpA ) je umístěn v rel operonu za genem kódujícím protein RelA. Na rozdíl od předchozích není lokalizován na plazmidu, ale v samotném chromozomu E. coli . Nejedná se tedy o postsegregační systém usmrcování, protože na rozdíl od plazmidů není chromozom „ztracen“ ... Jeho sekvence je částečně homologní se sekvencí pem i s jiným chromozomálním systémem E. coli , chpB . Exprese mazEF (MazE, 82 aminokyselin, což je protijed a MazF, 111 aminokyselin, jed), je inhibována guanosin-3 ', 5'-bispyrofosfátem (ppGpp) syntetizovaným RelA během extrémních nedostatků aminokyselin. V tomto případě je MazE degradován proteázou ClpPA, MazF může otrávit svůj (neznámý) cíl, což vede k buněčné smrti. Předpokládá se, že by to umožnilo přežití bakteriální populace obětováním mnoha deficitních buněk.

Bylo také prokázáno, že tento programovaný systém smrti může být indukován antibiotiky, která inhibují transkripci nebo translaci, jako je rifampicin , chloramfenikol nebo spektinomycin . Aktivuje se také systémem phd / doc, o kterém budeme krátce diskutovat.

Další chromozomální systém, relBE , byl objeven v genomu E. coli K12 a je homologní s několika plazmidovými nebo chromozomálními systémy E. coli nebo jinými gramnegativními bakteriálními druhy, stejně jako s chromozomálními systémy. dokonce archaea . Doposud nebyl u eukaryot nalezen žádný homolog, ale bylo prokázáno, že RelE z E. coli je také aktivní v Saccharomyces cerevisiae a že RelB působí proti jeho působení, alespoň částečně, přičemž úroveň exprese RelB je v postupu relativně nízká použitý.

Chromozomální homology CCD se nacházejí také v patogenním kmenem O157: H7 z E. coli , z hok / sok v E. coli , nebo, alternativně, na parDE v Mycobacterium tuberculosis , Vibrio cholerae , nebo Yersinia enterocolitica .

- phd / doc

Ve své lysogenní fázi je bakteriofág P1 E. coli přítomen jako plazmid s nízkým počtem kopií. Obsahuje modul phd / doc PSK, kde Phd (73 aminokyselin) je nestabilní antidotum a Doc (126 aminokyselin) stabilní jed. Phd je degradován proteázou ClpPX. Phd je schopen samoregulace operonu, ale je účinnější v přítomnosti Doc.

Docův cíl ​​dosud není znám, ale byl by zapojen do základního kroku syntézy proteinů. Bylo zjištěno, že přítomnost mazEF byla nutná pro zabíjení funkci po-segregační z phd / doc , což naznačuje, že Doc způsobuje inhibici translace protijedu bludiště, což vede ke smrti. Tyto dva mechanismy by proto byly spojeny do kaskády.

- omezení-modifikace

Dalším typem systému protijed-protilátka je systém omezení-modifikace (RM). Obvykle je jedním z bakteriálních systémů pro ochranu proti cizím DNA ( např. Fág ) přítomnost restrikčních enzymů, které štěpí molekulu DNA na specifickém místě nebo v jeho blízkosti. Ochrana genomu bakterií je zajištěna modifikací enzymů metylací molekuly DNA, čímž se zabrání působení restrikčních enzymů.

Tento systém funguje také pro stabilizaci plazmidů. Zásadní rozdíl oproti „klasickým“ systémům jed-antidotum spočívá v tom, že tyto dva enzymy netvoří komplex deaktivující restrikční enzym. Navíc účinek po segregačním zabíjení by nebyl způsoben rychlejší degradací methylázy, což by umožnilo uvolnění jedu. Byl tedy navržen model, kde by postupné ředění dvou enzymů během postupného dělení vedlo k bodu, kdy methylace již není dostatečně účinná, přičemž zbývajících několik restrikčních enzymů by způsobilo nenapravitelné poškození DNA.

Tabulka: Vlastnosti jedovatých protilátek

Systém Umístění Antidot , počet aminokyselin Jed , počet aminokyselin Terč jedu Proteáza degradující protijed
ccd plazmid F CcdA, 72 CcdB , 101 gyráza Lon
pem Plazmidy R1 a R100 PemI (nebo Kis), 84 PemK (nebo Kid), 110 DnaB? * Lon
parDE plazmid RK2 (nebo RP4) ParD, 83 ParE, 103 neurčeno Lon
mazEF (nebo chpA ) Chromozom E. coli MazE (nebo ChpAI), 82 MazF (nebo ChpAK), 111 neurčeno ClpAP
phd / doc Plazmid P1 Phd, 73 Doc, 126 neurčeno ClpXP

*: Nebyl získán žádný mutant rezistentní na PemK, ale nadprodukce DnaB inhibuje působení PemK, což naznačuje, že DnaB je cílem PemK.

Reference

<img src="https://fr.wikipedia.org/wiki/Special:CentralAutoLogin/start?type=1x1" alt="" title="" width="1" height="1" style="border: none; position: absolute;">