Sekvenování brokovnic

V genetice je brokovnicové sekvenování (doslova „brokovnicové“ sekvenování) metoda používaná k sekvenování náhodných řetězců DNA . Nazývá se tedy analogicky s rychle se rozšiřujícím kvazi náhodným výstřelovým modelem brokovnice  : tato metafora ilustruje náhodnou povahu počáteční fragmentace genomové DNA, kde je celý genom „nastříkán“., Trochu jako pelety tohoto typu rozptylu střelné zbraně.

Metodu ukončení řetězce sekvenování DNA („Sangerova metoda“) lze použít pouze pro krátké řetězce DNA o velikosti 100 až 1 000 párů bází . Kvůli tomuto omezení velikosti jsou delší sekvence rozděleny na menší fragmenty, které mohou být sekvenovány samostatně, a tyto sekvence jsou spojeny tak, aby poskytly celkovou sekvenci.

Existují dvě hlavní metody pro tento proces fragmentace a řazení. Chromozomu chůze (nebo „chromozomu walking“), postupuje na stacionární provazce kousek po kousku, zatímco sekvenční brokovnice je rychlejší, ale více komplexní proces, který používá náhodné fragmenty.

V sekvenční brokovnici je DNA náhodně rozdělena na mnoho malých segmentů, které jsou sekvenovány pomocí metody ukončení řetězce k získání údajů ( čtení ). Několikanásobné překrývající se čtení na cílové DNA se získá provedením několika iterací této fragmentace a sekvenování. Počítačové programy pak používají překrývající se konce z různých čtení k jejich sestavení do souvislé sekvence.

Sekvenování brokovnic byla jednou ze zakládajících technologií, která stála za projekty sekvenování celého genomu .

Příklad

Zvažte například následující dvě sady naměřených hodnot brokovnice :

Pramen Sekvence
Originál AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA
První broková sekvence AGCATGCTGCAGTCATGCT-------
-------------------TAGGCTA
Druhá broková sekvence AGCATG--------------------
------CTGCAGTCATGCTTAGGCTA
Rekonstrukce AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA

V tomto extrémně zjednodušeném příkladu žádné z přečtení nepokrývá celou délku původní sekvence, ale čtyři přečtení lze sestavit do původní sekvence pomocí překrytí jejich konců k jejich zarovnání a seřazení. Ve skutečnosti tento proces využívá obrovské množství informací, které jsou plné nejednoznačností a chyb řazení. Sestavování složitých genomů je dále komplikováno velkým množstvím opakujících se sekvencí , což znamená, že podobná krátká čtení mohou pocházet ze zcela odlišných částí sekvence.

K překonání těchto obtíží a přesnému sestavení sekvence je zapotřebí mnoho překrývajících se čtení pro každý segment původní DNA. Například pro dokončení projektu lidského genomu byla většina lidského genomu sekvenována při pokrytí 12krát nebo více, tj. Každá báze konečné sekvence byla v průměru přítomna ve 12 čteních. Navzdory tomu metody dostupné v roce 2004 nedokázaly izolovat nebo sestavit spolehlivou sekvenci pro přibližně 1% lidského ( euchromatického ) genomu .

Sekvenování brokovnice celý genom

Dějiny

Myšlenka použití sekvenování brokovnice celého genomu pro malé genomy (4000–7000 párů bází) byla poprvé navržena v roce 1979. První genom sekvenovaný brokovnicí byl sekvenován mozaikovým virem květáku , publikovaným v roce 1981.

Párování koncových sekvencí

Širší aplikace těží z párového koncového sekvenování, hovorově známého jako dvouhlavňové sekvenční brokovnice . Jak projekty sekvenování začaly uvažovat o delších a složitějších sekvencích DNA, několik skupin vědců si začalo uvědomovat, že užitečné informace lze získat sekvenováním obou konců fragmentu DNA. Přestože je sekvenování obou konců stejného fragmentu a sledování spárovaných dat těžší než sekvenování jednoho konce dvou samostatných fragmentů, s vědomím, že obě sekvence byly orientovány v opačných směrech a měly přibližně stejnou délku. Délka fragmentu nezávisle na sobě má bylo shledáno užitečným při rekonstrukci sekvence původního cílového fragmentu.

První publikovaný popis použití sekvenování spárovaných konců se datuje do roku 1990 jako součást sekvenování lidského lokusu HGPRT , ačkoli použití spárovaných konců v tomto případě bylo omezeno na vyplnění mezer po aplikaci. Tradičního postupu sekvenování brokovnic . První teoretický popis strategie čistého párového koncového sekvenování, za předpokladu fragmentů konstantní délky, pochází z roku 1991. V té době existovala komunitní shoda, že optimální délka fragmentu pro koncové sekvenování Pairwise bude trojnásobkem délky čtení sekvence. V roce 1995 Roach a kol. inovovat pomocí fragmentů proměnných velikostí a prokázat, že strategie sekvenování končí v čistých párech by byla možná na větších cílových genomech. Tuto strategii poté přijal Genomic Research Institute (TIGR) pro sekvenování genomu bakterie Haemophilus influenzae v roce 1995, poté Celera Genomics pro sekvenování genomu Drosophila melanogaster (octová muška) v roce 2000 a pak pro lidský genom.

Přístup

Pro uplatnění této strategie je vysokomolekulární řetězec DNA rozřezán na náhodné fragmenty, vybrané pro velikost (obvykle 2, 10, 50 a 150 kb ) a klonovány do vhodného vektoru . Klony jsou poté sekvenovány z obou konců pomocí metody ukončení řetězce, která vrací dvě krátké sekvence. Každá sekvence se nazývá koncové čtení nebo čtení 1 a čtení 2 a dvě čtení ze stejného klonu se nazývají párové páry . Vzhledem k tomu, že metoda ukončení řetězce může obvykle produkovat pouze čtení 500 - 1 000 bází na délku, ve všech kromě těch nejmenších klonů se párové páry zřídka překrývají.

Shromáždění

Původní sekvence je rekonstruována z načtení pomocí softwaru pro sekvenční montáž . Nejprve se překrývající se čtení shromažďují v delších složených sekvencích nazývaných kontigy . Kontigy lze propojit na lešení sledováním spojení mezi dvojicemi partnerů. Vzdálenost mezi kontigami lze odvodit z pozic párujících se párů, pokud je známa průměrná délka fragmentů v knihovně a má omezené okno odchylky. V závislosti na velikosti prostoru mezi kontigami lze k nalezení sekvence v prostorech použít různé techniky. Pokud je mezera malá (5-20 kb), měla by se k amplifikaci oblasti použít polymerázová řetězová reakce (PCR), následovaná sekvenováním. Pokud je mezera velká (> 20 kb), pak je velký fragment klonován do speciálních vektorů, jako jsou bakteriální umělé chromozomy (BAC), potom je vektor sekvenován.

Výhody a nevýhody

Zastánci tohoto přístupu tvrdí, že je možné sekvenovat celý genom najednou pomocí velkých řad sekvencerů, což činí celý proces mnohem efektivnějším než tradiční přístupy. Kritici tvrdí, že zatímco tato technika může rychle sekvenovat velké oblasti DNA, její schopnost správně tyto oblasti následně spojit je diskutabilní, zejména u genomů s opakujícími se oblastmi . Jak se programy sekvenčního šití stávají sofistikovanějšími a výpočetní výkon se zlevňuje, je možné překonat toto omezení .

Deka

Pokrytí (hloubka nebo hloubka čtení) je průměrný počet čtení představujících daný nukleotid v rekonstruované sekvenci. Lze jej vypočítat z délky původního genomu ( G ), počtu čtení ( N ) a průměrné délky čtení ( L ) prostřednictvím výpočtu . Například hypotetický genom s 2 000 bazickými páry rekonstruovanými z 8 čtení s průměrnou délkou 500 nukleotidů bude mít redundanci 2x (dvakrát). Tento parametr lze také použít k odhadu dalších veličin, například procenta genomu pokrytého čtením (někdy také nazývané pokrytí). Je žádoucí brokovnice s vysokým pokrytím, protože může překonat chyby v základnách volání a sestavení . Pole teorie sekvenování DNA se zabývá vztahy spojenými s takovými veličinami.

Někdy se rozlišuje mezi pokrytím sekvence a fyzickým pokrytím . Pokrytí sekvence je průměrný počet čtení ze základny (jak je popsáno výše). Fyzické pokrytí je průměrný počet, kolikrát je základna načtena nebo pokryta čtením páření.

Hierarchické sekvenování brokovnic

Ačkoli sekvenční brokovnice lze teoreticky použít na genomy všech velikostí, její přímá aplikace na sekvenování velkých genomů (např. Lidského genomu) byla omezena až do konce 90. let, kdy se chopil technologický pokrok. Nakonec bylo praktické manipulovat s obrovské množství komplexních dat generovaných v procesu. Historicky se věřilo, že sekvenování brokovnic celého genomu je omezeno jak velikostí velkých genomů, tak přidanou složitostí vysokého procenta opakující se DNA (více než 50% pro lidský genom) přítomných ve velkých genomech. Nebylo široce přijímáno, že úplné genomové sekvenování broků použité na velký genom poskytne spolehlivé údaje. Z těchto důvodů musely být před sekvenováním brokovnic použity jiné strategie, které snížily výpočetní zátěž sestavení sekvence . V hierarchickém sekvenování, známém také jako sekvenování shora dolů , je před vlastním sekvenováním vytvořeno genetické mapování genomu s nízkým rozlišením. Z této mapy je pro sekvenování vybrán minimální počet fragmentů, které pokrývají celý chromozom. Tímto způsobem je vyžadováno minimální množství řazení a sestavení s vysokou propustností.

Amplifikovaný genom je nejprve rozřezán na větší kousky (50-200 kb) a poté klonován do bakteriálního hostitele pomocí BAC nebo umělých chromozomů odvozených od P1 (PAC). Protože mnoho kopií genomu bylo stříháno, náhodné fragmenty obsažené v těchto klonech mají různé konce a při dostatečném pokrytí (viz část výše) je teoreticky možné najít lešení ( lešení ) BAC kontigů, které pokrývá celý genom. Toto lešení se nazývá obkladová cesta .

Jakmile byla nalezena cesta dlaždice, BAC, které tvoří tuto cestu, jsou náhodně rozřezány na menší fragmenty a mohou být sekvenovány pomocí brokovnice v menším měřítku.

Ačkoli úplné sekvence BAC kontig nejsou známy, na druhé straně jsou známy jejich vzájemné orientace. Existuje několik metod k odvození tohoto pořadí a výběru BAC, které tvoří cestu dlaždic. Obecnou strategií je identifikovat polohy klonů vůči sobě navzájem, poté vybrat co nejméně klonů potřebných k vytvoření souvislého lešení pokrývajícího celou oblast zájmu. Pořadí klonů se odvodí určením toho, jak se překrývají. Překrývající se klony lze identifikovat několika způsoby. Malá radioaktivně nebo chemicky značená sonda obsahující místo značené sekvencí (STS) může být hybridizováno na mikročip, na kterém jsou klony otištěny. Tímto způsobem lze identifikovat všechny klony, které obsahují konkrétní sekvenci v genomu. Konec jednoho z těchto klonů lze poté sekvenovat, aby se získala nová sonda, a postup se opakuje metodou zvanou chromozomové průzkumy.

Alternativně může být knihovna BAC štěpena restrikčními enzymy . Je odvozeno, že dva klony, které mají několik společných velikostí fragmentů, se překrývají, protože společně obsahují několik restrikčních míst rozmístěných podobným způsobem. Tato metoda genomového mapování se nazývá restrikční otisky prstů, protože identifikuje soubor restrikčních míst obsažených v každém klonu. Jakmile bylo zjištěno překrytí mezi klony a je známo jejich pořadí ve vztahu k genomu, je brokovnicí sekvenováno lešení s minimální podmnožinou těchto kontigů, které pokrývá celý genom.

Protože nejprve zahrnuje vytvoření mapy genomu s nízkým rozlišením, hierarchické sekvenování brokovnic je pomalejší než sekvenování brokovnic celého genomu, nicméně je méně závislé na počítačových algoritmech. Proces vytváření bank BAC a výběr cesty dlaždic však činí hierarchické sekvenování brokovnic pomalé a pracné. Nyní, když byla technologie upravena a data se ukázala jako spolehlivá, se rychlost a nákladová efektivita sekvenování brokovnic celého genomu stala primární metodou sekvenování genomu.

Nové technologie sekvenování

Klasické sekvenování brokovnic bylo založeno na metodě Sangerova sekvenování  : byla to nejpokročilejší technika pro sekvenování genomů v období od roku 1995 do roku 2005. Strategie brokovnic je stále používána dnes, ale je založena na jiných. sekvenční čtení.

Sekvenování s krátkým čtením nebo „příští generací“ produkuje kratší čtení (25 až 500 bp ), ale několik stovek tisíc nebo milionů čtení za relativně krátkou dobu (v řádu jednoho dne). Výsledkem je vysoké pokrytí, ale proces montáže je výpočetně mnohem náročnější. Tyto technologie jsou výrazně lepší než Sangerovo sekvenování kvůli velkému objemu dat a relativně krátké době potřebné k sekvenování celého genomu.

Metagenomické sekvenování brokovnic

Odečty 400-500 párů bází jsou dostatečné k určení druhu nebo kmene, ke kterému patří organismus, ze kterého DNA pochází, za předpokladu, že jeho genom je již známý, například pomocí taxonomického klasifikačního softwaru založeného na K-mer . Díky milionům odečtů ze sekvenování vzorku životního prostředí nové generace je možné získat komplexní přehled o jakémkoli složitém mikrobiomu s tisíci druhů, jako je střevní flóra . Výhody oproti sekvenování amplikonu z 16S rRNA jsou:

Citlivost metagenomického sekvenování z něj činí atraktivní volbu pro klinické použití. Zdůrazňuje však problém kontaminace vzorku nebo sekvenčního potrubí.

Podívejte se také

Poznámky

Reference

  1. Staden, „  Strategie sekvenování DNA využívající počítačové programy  “, Nucleic Acids Research , sv.  6, n O  70,1979, str.  2601–10 ( PMID  461197 , PMCID  327874 , DOI  10.1093 / nar / 6.7.2601 )
  2. Anderson, „  Sekvenování brokovnicové DNA pomocí klonovaných fragmentů generovaných DNázou I  “, Nucleic Acids Research , sv.  9, n o  13,devatenáct osmdesát jedna, str.  3015–27 ( PMID  6269069 , PMCID  327328 , DOI  10.1093 / nar / 9.13.3015 )
  3. Konsorcium pro sekvenování lidského genomu, „  Dokončení euchromatické sekvence lidského genomu  “, Nature , sv.  431, n O  7011,21. října 2004, str.  931–945 ( PMID  15496913 , DOI  10.1038 / nature03001 , Bibcode  2004Natur.431..931H )
  4. (in) Gardner, Howarth, Hahn a Brown-Luedi, „  Kompletní nukleotidová sekvence infekčního klonu viru mozaiky květáku sekvenováním brokovnice M13mp7  “ , Nucleic Acids Research , sv.  9, n o  12,25. června 1981, str.  2871–2888 ( ISSN  0305-1048 , PMID  6269062 , PMCID  326899 , DOI  10.1093 / nar / 9.12.2871 , číst online )
  5. (in) Doctrow, „  Profil Joachima Messinga  “ , Sborník Národní akademie věd , sv.  113, n o  29,19. července 2016, str.  7935–7937 ( ISSN  0027-8424 , PMID  27382176 , PMCID  4961156 , DOI  10,1073 / pnas.1608857113 )
  6. Edwards a Caskey, T, „  Uzavírací strategie pro náhodné sekvenování DNA  “, Methods: A Companion to Methods in Enzymology , sv.  3, n o  1,1991, str.  41–47 ( DOI  10.1016 / S1046-2023 (05) 80162-8 )
  7. Edwards, Voss, H., Rice, P. a Civitello, A., „  Automated DNA sequencing of the human HPRT locus  “, Genomics , sv.  6, n O  4,1990, str.  593–608 ( PMID  2341149 , DOI  10.1016 / 0888-7543 (90) 90493-E )
  8. Roach, Boysen, C, Wang, K a Hood, L, „  Pairwise end sequencing: unified approach to genomic mapping and sequencing  “, Genomics , sv.  26, n O  21995, str.  345–353 ( PMID  7601461 , DOI  10.1016 / 0888-7543 (95) 80219-C )
  9. Fleischmann, „  Náhodné sekvenování a shromáždění celého genomu Haemophilus influenzae Rd  “, Science , sv.  269, n O  5223,1995, str.  496–512 ( PMID  7542800 , DOI  10.1126 / science.7542800 , Bibcode  1995Sci ... 269..496F , číst online )
  10. Adams, „  Sekvence genomu Drosophila melanogaster  “, Science , sv.  287, n O  5461,2000, str.  2185–95 ( PMID  10731132 , DOI  10.1126 / science.287.5461.2185 , Bibcode  2000Sci ... 287.2185. , Číst online )
  11. Meyerson, Gabriel a Getz, „  Pokroky v porozumění genomům rakoviny prostřednictvím sekvenování druhé generace  “, Nature Reviews Genetics , sv.  11, n o  10,2010, str.  685–696 ( PMID  20847746 , DOI  10.1038 / nrg2841 )
  12. Dunham, I. Sekvenování genomu . Encyclopedia of Life Sciences, 2005. DOI : 10.1038 / npg.els.0005378
  13. Venter, JC 'Shotgunning the Human Genome: A Personal View.' Encyclopedia of Life Sciences, 2006.
  14. Gibson, G. a Muse, SV Primer genomové vědy . 3. vyd. Str. 84
  15. Vážený, mapování PH genomu . Encyclopedia of Life Sciences, 2005. DOI : 10.1038 / npg.els.0005353 .
  16. Karl, „  Sekvenování nové generace: Od základního výzkumu k diagnostice  “, Clinical Chemistry , sv.  55, n O  4,2009, str.  41–47 ( PMID  19246620 , DOI  10.1373 / clinchem.2008.112789 )
  17. Metzker, „  Sekvenční technologie - nová generace  “, Nat Rev Genet , sv.  11, n o  1,2010, str.  31–46 ( PMID  19997069 , DOI  10.1038 / nrg2626 , číst online )
  18. Roumpeka, „  Přehled bioinformatických nástrojů pro biologický průzkum z metagenomických sekvenčních dat  “, Frontiers in Genetics , sv.  8,2017, str.  23 ( PMID  28321234 , PMCID  5337752 , DOI  10.3389 / fgene.2017.00023 )
  19. Gu, „  Clinical Metagenomic Next-Generation Sequencing for Pathogen Detection  “, Annual Review of Pathology: Mechanismy of Disease , sv.  14,2018, str.  319–338 ( PMID  30355154 , PMCID  6345613 , DOI  10.1146 / annurev-pathmechdis-012418-012751 )
  20. Thoendel, „  Dopad kontaminace DNA na soupravy pro amplifikaci celého genomu používané pro metagenomické sekvenování brokovnic pro diagnostiku infekce  “, Journal of Clinical Microbiology , sv.  55, n O  6,2017, str.  1789–1801 ( PMID  28356418 , PMCID  5442535 , DOI  10.1128 / JCM.02402-16 )

Související články

Další čtení

externí odkazy