Enzymový imunotest ELISA ( anglický enzymově vázaný imunosorbentní test , doslovně „technika enzymově vázaný imunosorbent“, tj. Technika pevné podpory enzymového imunotestu) je laboratorní vyšetření. Tato metoda se používá hlavně k detekci přítomnosti protilátky nebo antigenu ve vzorku .
Tato technika biochemické analýzy spadá do obecnějšího rámce imunoenzymatických detekčních technik (nebo EIA pro enzymové imunotesty ), ve kterých se sleduje rozpoznání antigenu studovaného specifickou protilátkou (nebo naopak protilátky studované antigenem) reakcí katalyzovanou enzymem, který uvolňuje barevnou složku, jejíž množství se stanoví spektroskopií . K tomu je antigen rozpoznán protilátkou kovalentně navázanou na enzym (nebo naopak protilátka je rozpoznána značeným antigenem). Vazba značené molekuly povede po použití chromogenního nebo fluorogenního substrátu pro enzym spojený s protilátkou k emisi barevného nebo fluorescenčního signálu. Tyto techniky mají být na rozdíl od radioimunologické testy (RIA nebo pro rozhlasové imunotesty ), ve které je značení, které provádí radioelement jehož radiační aktivita se měří v počtu rozpadů za sekundu. Aby se usnadnilo provádění této techniky, zejména v případě velkého počtu vzorků, které mají být analyzovány, je protilátka specifická pro požadovaný antigen nebo antigen rozpoznávaný požadovanou protilátkou spojena s použitým podkladem, který je jím pokryt, odtud název imunoabsorpční techniky. Existuje několik variant provozních protokolů, které umožňují zvýšit specificitu nebo citlivost rozpoznávání antigenu (nepřímá, sendvičová nebo kompetitivní ELISA).
Vzhledem k tomu, že ELISA lze použít k hodnocení přítomnosti antigenu i protilátky ve vzorku, je účinným nástrojem pro stanovení koncentrací protilátek v séru (jako u testu HIV nebo testu HIV. Nilský virus ), pouze k detekovat přítomnost antigenu. Rovněž našel uplatnění v potravinářském průmyslu k detekci potravinových alergenů , jako je mléko , arašídy , ořechy a vejce . Jedná se o jednoduchý, snadno použitelný a levný test. Je omezena dostupností specifické protilátky.
Pro zlepšení citlivosti detekce antigenu nemusí být protilátka, která rozpoznává požadovaný antigen, navázána na enzym, ale bude rozpoznávána specificky druhou protilátkou, která bude sama navázána na enzym .
Enzym působí jako zesilovač: i když je připojeno několik protilátek konjugovaných s enzymem, enzym katalyzuje tvorbu mnoha signálů, což činí tento test velmi citlivým, ale také zvyšuje počet falešně pozitivních výsledků . Je proto logicky nutné zajistit kontrolní jamky.
Kroky takzvané nepřímé ELISA, nejčastěji používané k určení koncentrace protilátek v séru, jsou:
Sendvičová ELISA je méně častá (klinická) varianta této techniky, která se používá k detekci vzorku antigenu v séru nebo jiném vzorku. Na druhé straně je tato technika ve výzkumu velmi běžná.
Proces probíhá v širším obrysu takto:
Jak je však ilustrováno, obvykle existuje další krok, přidání detekčních protilátek , aby se zabránilo tvorbě protilátek konjugovaných s enzymem pro každý antigen . Použití vázaného enzymu, který rozpoznává Fc skupinu jiných protilátek, umožňuje jeho použití v různých situacích a snižuje náklady na postup.
Tato varianta umožňuje stanovení antigenu pomocí principu vazebné kompetice:
Existuje tedy konkurence mezi značenými antigeny (ve známém množství) a neznačenými (v množství, které se stanoví) o jejich vazbu na protilátky, které chybí. Čím větší je počet antigenů, které mají být testovány, tím větší je jejich podíl mezi antigeny zadrženými protilátkami, a tím slabší bude signál. Naopak, pokud je počáteční koncentrace antigenu nízká, bude signál silný.
ELISA může být provedena pro kvantitativní nebo kvalitativní účely:
Přímá ELISA se používá pro stanovení různých proteinů. Některé příklady čerpané z aplikací v lékařské farmakologii: hormony štítné žlázy, koncentrace léčiva (k posouzení souladu a / nebo úpravě dávky ) atd.
Nejznámější aplikací pro širokou veřejnost je testování HIV první linie .
Technika ELISA umožňuje detekci anti- HIV protilátek v krevním séru (proto termín „séropozitivní“ nebo „séronegativní). Tato technika je velmi citlivý (ve většině případů jsou zjištěny, a“ falešně negativní "(= negativní zkoušky, kdy je pacient séropozitivní) jsou téměř vyloučeny, přinejmenším pokud je test proveden do tří měsíců po infekčním kontaktu) a přijatelnou specificitu (nízká míra „ falešně pozitivních výsledků “ (= pozitivní test reakcí protilátky s nespecifickým antigenem) V případě pozitivní sérologie anti-HIV by však vzorky měly být podrobeny potvrzovacím testům, jako je Western blot , který používá techniku založenou na elektroforéze a jejíž chybovost je extrémně nízká.